GATA4介导自噬抑制椎间盘内高氧引起髓核细胞衰老的作用和机制研究

Nucleus pulposus cells senescence plays an important role in the process of intervertebral disc degeneration. The nucleus pulposus cells are in a hypoxic environment in normal healthy intervertebral discs and in a hyperoxic environment in degenerative discs due to angiogenesis. We demonstrated that hyperoxia can promote the generation of reactive oxygen species to induce premature senescence of nucleus pulposus cells. The hyperoxia can induce autophagy in nucleus pulposus cells and the inhibition of autophagy aggravates the senescence of nucleus pulposus. However, the mechanism of how hyperoxia induces the senescence of nucleus pulposus remains unknown. The pathway that GATA4 activates NF-κB to initiate the senescence-associated secretory phenotype(SASP) is proved to be an important pathway leading to cell senescence. GATA4 is mainly regulated by selective autophagy mediated by p62. Thus,we hypothesize that the hyperoxia causes DNA damage of the nucleus pulposus cells in intervertebral disc. The DNA damage response regulators ATM and ATR are upregulated and inhibit the p62- mediated selective autophagy. The accumulation of GATA4 initiate the SASP to induce nucleus pulposus cells senescence. In this study, we will elucidate the significance of GATA4 in intervertebral disc degeneration and investigate the molecular mechanism of GATA4 mediated autophagy inhibit nucleus pulposus cells senescence through in vitro and in vivo experiments. These results will provide an avenue for the investigation of the mechanism and biological therapies of IDD.

椎间盘髓核细胞衰老是椎间盘退变的关键环节。正常椎间盘中髓核细胞处于生理性低氧环境，退变椎间盘中，由于血管长入引起椎间盘内高氧。本课题组证明盘内高氧能够引起髓核细胞过度产生活性氧引起髓核细胞衰老。预实验发现高氧能够上调髓核细胞自噬水平，抑制自噬加剧髓核细胞衰老。但是，盘内高氧引起髓核细胞衰老的机制尚不明确。GATA4激活NF-κB启动衰老相关分泌表型(SASP)被证明是引起细胞衰老独立的重要通路，而GATA4主要通过p62介导的选择性自噬调控。因此，我们提出科学假设：椎间盘内高氧引起髓核细胞DNA损伤，上调DNA损伤反应调节因子ATM和ATR，抑制P62介导的选择性自噬对GATA4降解，启动SASP，引起髓核细胞衰老。本课题旨在通过体内外实验，阐明GATA4在椎间盘退变关键重要作用，探索GATA4介导自噬抑制髓核细胞衰老的分子机制，研究成果将为椎间盘退变的机制研究和生物治疗提供新的思路。

GATA4介导自噬抑制椎间盘内高氧引起髓核细胞衰老的作用和机制研究 .摘要：.背景：椎间盘髓核细胞衰老减少是椎间盘退变的关键环节。正常椎间盘中髓核细胞（NPCs）减少后无法由位于椎间盘上下两侧的透明软骨内的软骨终板干细胞（CESCs）进行补充，本研究对软骨终板干细胞来源的外泌体（CESCs-Exos）在促进 CESCs转分化为 NPCs 中的作用进行研究。.研究内容：通过分离大鼠CESCs，我们培养提取了CESCs来源的外泌体并分析CESCs 自分泌外泌体是否可以通过激活缺氧诱导因子(HIF)-1α/Wnt 通路和增加 GATA4/TGF-β 表达，促进 CESC 迁移和转分化为 NPCs；在人体标本中进行验证GATA4调控分化的作用，并对突然低氧或梯度低氧促进CESCs分化为NPCs的效果进行研究。.研究结果：经过CESC-Exos处理后的CESCs表达HIF-1α蛋白水平明显增加，CESC-Exos通过激活HIF-1α信号通路促进了CESC的分化和迁移。 对转录组学测序结果进行KEGG分析和GO分析发现，分化退变的软骨终板中Wnt信号通路被激活，而且HIF-1a可以通过调控Wnt通路来促进CESCs的分化和迁移。 激活Wnt信号通路后，GATA4表达增加;对CESCs进行过表达GATA4，结果提示，GATA4通过TGF-β调控软骨终板干细胞（CESC）侵袭、迁移和分化。在动物实验中，过表达GATA4的CESCs可以加强对椎间盘的修复作用。收集椎间盘退变患者的软骨终板组织进行研究，结果提示GATA4在CESCs的分化中可能起到重要作用。GATA4通过促进CESCs分化为髓核样细胞，进而加速补充衰老减少的髓核细胞，延缓椎间盘退变的进展。进一步研究椎间盘内低氧环境对CESCs分化为NPCs相关作用，将CESCs突然从21%氧环境转移到3%的氧环境中培养，结果表明铁死亡明显增加，向髓核细胞样分化被抑制；在梯度低氧（21%-15%-12%-9%-6%-3%）培养CESCs过程中，CESCs向髓核分化增加，而与梯度缺氧的CESCs相比，铁死亡明显降低；结果提示，对于椎间盘的治疗，使用低氧培养处理的髓核细胞可能会有更好的治疗效果。.科学意义：本研究，通过分析促进CESCs分化为NPCs方法，如采用CESCs来源的外泌体处理及梯度低氧诱导，为椎间盘内髓核细胞的快速补充提供