BEND3的染色质定位及功能研究

It’s estimated that approximately 70% to 80% of CpG dinucleotides are methylated in mammalian genomes. However, CpG islands (CGIs) which are characterized by increased CpG content and GC percentage remain free of DNA methylation. Approximately 70% of annotated gene promoters are associated with CGIs, including most housekeeping genes and many tissue-specific genes, which suggests a function of CGIs in regulating gene expression. However, the precise mechanisms by which CpG islands contribute to regulatory element function remain poorly understood. It has been demonstrated that un-methylated CpG signals in CGIs can be interpreted by some proteins, which contain a specific un-methylated CpG binding motif, ZF-CXXC motif. With DNA pull down assay in vitro, we found that BEND3 preferentially bound to un-methylated CpG fragments. Moreover, BEND3 doesn’t possess the ZF-CXXC motif, which may suggest a novel binding mechanism. In this application, we prepare to investigate the molecular mechanism by which BEND3 specifically recognizes un-methylated CpG; we also intend to explore the chromatin localization of BEND3 using immunostaining and ChIP-seq technology. In addition, we will use Bend3 knock-out cell lines and high-throughput sequencing technology to unravel the functions of BEND3. Our results may give more clues about how signals of un-methylated CpG are interpreted and involved in regulation of gene expression.

哺乳动物基因组中，70-80%的CpG是甲基化的。然而富含GC的CpG岛区域却很少被甲基化。根据已有注释，70%的基因都含有CpG岛启动子，不仅包括大多数管家基因，还包括一些组织特异性表达的基因，CpG岛很可能参与了对这些基因的转录调控。然而，非甲基化CpG岛调控基因表达的机制尚不清楚。目前已知一些可以依赖ZF-CXXC结构域来特异性结合非甲基化CpG的蛋白。利用体外pull down实验，我们发现BEND3可以特异性结合非甲基化的CpG。但是，BEND3并没有ZF-CXXC结构域，说明存在一种新的机制可以解读非甲基化的CpG。本申请试图阐明BEND3结合非甲基化CpG的分子机制；利用免疫染色和ChIP-seq技术研究BEND3在染色质上的定位；通过建立敲除细胞系，结合高通量测序技术研究BEND3对于转录调节的功能。研究结果将有助于理解非甲基化CpG信号的解读及其对转录调控的影响。

哺乳动物基因组中，70-80%的CpG是甲基化的。然而富含GC的CpG岛区域却很少被甲基化。根据已有注释，70%的基因都含有CpG岛启动子，不仅包括大多数管家基因，还包括一些组织特异性表达的基因，CpG岛很可能参与了对这些基因的转录调控。启动子区域DNA 的甲基化修饰可以排斥特定转录因子的结合，并招募抑制性因子,维持基因沉默的状态。而这些非甲基化的CpG 也可以招募特定的结合蛋白来行使功能。然而，目前对于非甲基化CpG 结合蛋白的研究十分有限，并且主要围绕在含有ZF-CXXC 结构域的蛋白上。因此，寻找其他非甲基化DNA 的结合蛋白对于解读CpG 岛的功能至关重要。利用体外pull down实验，我们发现BEND3可以特异性结合非甲基化的CpG。但是，BEND3并没有ZF-CXXC结构域，说明存在一种新的机制可以解读非甲基化的CpG。本项目试图解读BEND3与非甲基化DNA 结合的机制，并研究其对基因转录和染色质状态的影响。通过本项目的研究，我们取得了以下几方面成果：首先，我们证明了BEND3在体外选择性结合非甲基化CpG序列，并且明确了BEND3中第四个BEN结构域是重要的；其次，我们发现BEND3主要定位在含有非甲基化CpG岛的启动子区域，并且BEND3的富集程度与基因的表达水平呈正相关。基因的表达水平越高，BEND3的信号越高。但是BEND3的缺失对于其结合位点的DNA甲基化水平没有影响；最后，我们发现，在小鼠胚胎干细胞中BEND3的缺失不会影响基因的转录水平，但是在RA诱导的干细胞分化过程中，BEND3的缺失会导致部分基因的上调或者下降减弱。