利用CLIP-Seq数据发现胃癌相关新miRNA及功能和表达调控机制研究

MiRNAs play important roles in gastric cancer initiation and progression, so it's of vital importance to investigate function and regulation of miRNAs in gastric cancer. Previously we identified novel miRNAs from Argonaute CLIP-Seq data, and found some of them were upregulated in gastric cancer tissues, indicating that there are novel miRNAs playing important roles in gastric cancer. We plan to systematically identify novel miRNAs through data minning; verify them by using miRNA cloning and Northern Blotting; check the correlation between expression of these novel miRNAs with gastric cancer classification and progression; examine effects of these miRNAs on gastric cancer cell proliferation, apoptosis, migration, invassion, colonal formation and tumorigensis by gain-of-function and loss-of-function analysis; identify targets of these miRNAs by bioinformatic prediction, Western Blotting, luciferase reporter assays and functional rescue assays; and characterize promoter and enhancer, and investigate cis- and trans- regulatory mechanisms of these miRNAs by ChIP, DNA methylation analysis and chromosome conformation capture assays. The aim of this study is to explore pathways these novel miRNAs associated with gastric cancer may participate in and shed new light on gastric cancer diagnosis and treatment.

MiRNA 在胃癌发生发展中发挥重要作用，研究相关miRNA在胃癌中的功能和表达调控机制对于胃癌诊断和治疗具有重要意义。我们从Ago蛋白CLIP-Seq数据中挖掘并鉴定了一批新miRNA，发现其中部分在胃癌组织中表达升高，提示存在全新的miRNA在胃癌发生或进展中发挥作用。本项目拟在此基础上系统鉴定潜在新miRNA，利用miRNA克隆和Northern 等方法验证这些新miRNA；考察它们在胃癌中的表达与分型和进展的相关性；通过功能研究揭示胃癌相关新miRNA对细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及克隆形成和裸鼠成瘤能力的影响；运用生物信息学预测并利用免疫印迹、报告基因分析及功能挽救实验等方法鉴定新miRNA发挥功能的靶基因；鉴定miRNA顺式调控元件、并通过ChIP及3C等方法研究这些miRNA上游表达调控机制。以探寻胃癌相关新miRNA完整分子调控通路，最终为探索胃癌诊断和治疗方法提供新思路。

MiRNA在胃癌发生发展中发挥重要作用，研究相关miRNA在胃癌中的功能和表达调控机制对于胃癌诊断和治疗具有重要意义。我们利用公开的Ago蛋白CLIP-Seq数据，挖掘并鉴定了一批新miRNA，发现其中部分在胃癌组织中表达升高的新miRNA，揭示了这些新miRNA在胃癌发生进展中发挥重要作用。利用miR-Deep等工具鉴定出24个高度可能的潜在新miRNA。在SGC-7901、AGS和SNU-16细胞中利用realtime-qPCR及Northern等方法验证了其中8个新miRNA的真实存在。在30例胃癌及癌旁对照组织中分析了这8个miRNA的表达，发现MC3表达明显升高。提示其在胃癌中发挥重要功能。在SGC-7901及AGS细胞中过表达MC3，结果表明MC-3具有提高细胞增殖，促进细胞迁移的能力。同时我们发现C-Jun和miR-139形成负反馈环路，并在胃癌中异常，论文发表在《Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research》上。.我们设计了基于近距离连接反应，偶联高通量测序的方法，高通量鉴定miRNA的靶基因。我们通过特异性富集的方法，捕获特定miRNA参与的RNA相互作用。通过高通量测序分析，我们发现:1)miRNA的靶基因主要是mRNA，约占全部target的3/4，其中绝大多数的靶位点都位于3‘UTR，这一现象与我们认识的miRNA识别靶基因是一致的。2)结合表达谱数据，我们发现的靶基因在miRNA过表达后表达下调。因此提示我们发现的miRNA基因是真实的。3)miRNA与靶基因结合基本存在5种不同的模式，而经典的seed匹配模式只是其中之一。不过miRNA的5’配对对于靶位点的识别至关重要。.在研究应用近距离连接实验过程中，我们同时关注染色体高级结构及其功能上，发现染色体的高级结构对于蛋白质密码子使用也有调控作用，文章发表在《bioinformatics》上，并在此基础上又发现重要的结构蛋白CTCF在有丝分裂期维持与染色体高级结合的特点，与中科院马普计算所合作发现染色体高级结构对于节律基因和非编码RNA调控等的重要意义，这些工作均已发表，并获得了良好的评价。还利用染色体分离偶联高通量测序技术，鉴定到一系列有丝分裂书签RNA，并验证其中部分书签RNA对于维持染色质高级结构的意义。