稻瘟病抗性蛋白Pi36卷曲螺旋结构域免疫自激活的分子机理

Plants have evolved structurally conserved resistance proteins containing a N-terminal coiled-coil (CC) or Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain, a central nucleotide-binding (NB) domain and C-terminal leucine-rich repeats (LRRs). The CC domains of some CC-NB-LRR proteins can trigger autoimmunity in the model plant Arabidopsis. All the rice blast R genes, except Pi-d2 and pi21, encode CC-NB-LRR type proteins. They recognize their cognate effectors, either individually or in pair, to activate race-specific resistance against the blast fungus Magnaporthe oryzae. However, there are not any record that the CC domain alone of these proteins is sufficient to activate immunity. Pi36 alone recognizes some Chinese rice blast isolates, although the avirulence effector is unknown. In our preliminary investigation, we found that the CC domain alone of Pi36 can trigger cell death in Nicotiana benthamiana and rice protoplasts, and its ectopic expression from pathogen-inducible promoter confers resistance against powdery mildew in Arabidopsis and the blast fungus M. oryzae in rice. To address the question of how the autoimmunity of Pi36CC is achieved, we propose this project to investigate: 1) the critical amino acid residues for activation of immunity via point mutations, 2) the regulation of NB-LRR on CC-mediated auto-activated immunity, 3) the biological function of the Pi36 CC-interacting protein 1 (PCIP1), and 4) signaling pathways involved in Pi36 CC-mediated auto-activated immunity via transpcriptome analysis. Data from this project should provide insight into the molecular mechanism of Pi36-meidated resistance against rice blast disease and reveal the potential value of Pi36 CC domain in engineering broad-spectrum disease-resistant rice via biotechnology.

稻瘟病抗性基因除Pi-d2和pi21外，均编码CC-NB-LRR蛋白，分别通过单个或成对的两个基因产生小种特异性抗病性，但尚无稻瘟病抗性蛋白卷曲螺旋结构域（CC）可产生免疫自激活的报道。Pi36单个基因可介导小种特异性抗性，但抗病分子机理不清楚。在前期研究中为筛选可产生免疫自激活的CC结构域，从8个稻瘟病抗性蛋白中鉴定出Pi36的CC具有免疫自激活的特性。该结构域在本氏烟和水稻原生质体中瞬时表达可激发细胞死亡，在拟南芥中表达可增强对白粉病的抗性，在水稻中表达可增强对稻瘟病的抗性。在此基础上，本项目拟通过突变分析Pi36 CC中导致细胞死亡的关键氨基酸残基，其他结构域对CC免疫自激活的影响，Pi36CC互作蛋白PCIP1的功能分析以及Pi36CC免疫自激活影响的信号通路，以期解析Pi36的CC结构域产生免疫自激活的分子机制，为通过生物技术构筑稻瘟病广谱抗性提供新的基因资源和理论指导。

植物在长期进化中产生了一类在结构上保守的抗性（R）蛋白，这类蛋白包含一个N端的卷曲螺旋（CC）结构域，一个中部的核苷酸绑定（NBS）结构域和一个C端的富含亮氨酸的重复序列（LRRs）。在拟南芥中，这类R蛋白的CC结构域能够产生免疫自激活。大多数抗稻瘟病基因编码CC-NB-LRR类蛋白，但是其CC结构域的功能还知之甚少。本项目从稻瘟病抗性基因Pi36, RGA4, RGA5, Pikm-1, Pikm-2, Pish, Pita 和Pb1中，分析它们编码的CC结构域，发现只有Pi36的CC能够触发细胞死亡，即免疫自激活。Pi36CC的免疫自激活依赖于其自身相互作用和在细胞质中的积累。但Pi36CC的免疫自激活会受NBS和LRR结构域的抑制，而且位于NBS中的V503位点是抑制免疫自激活的关键。用RPW8.2的启动子在拟南芥中表达Pi36CC能够提高拟南芥对白粉病的抗性，用PBZ1的启动子在水稻中表达Pi36CC能够提高稻瘟病抗性。此外，Pi36CC能够与乙烯信号中的关键转录因子EIL1（即PCIP1）互作，过量表达EIL1也会产生免疫自激活。因此，Pi36CC可能是通过EIL1产生免疫自激活。与此相一致的是，与Pi36CC结构相似的RPW8.1和RPW8.2均具有免疫自激活特性。其中，RPW8.1可明显促进乙烯信号，而乙烯信号反馈调控RPW8.1的表达。与Pi36CC相似，RPW8.2也只能在细胞质中激发细胞死亡。总之，Pi36CC及其同源蛋白RPW8产生的免疫自激活，可以通过控制性表达，定向构筑抗病性。