基因工程法制备兼具超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性的35肽

作为机体内的主要抗氧化酶，超氧化物歧化酶（SOD）与谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）不仅在活性上能协同作用，还能组成相互保护的防御群，更有效的清除机体内自由基，保护细胞免遭氧化损伤，维持体内代谢平衡。本项目拟将具有超氧化物歧化酶活性的17肽和具有谷胱甘肽过氧化物酶活性的15肽通过3肽Linker串联起来，并通过天然酶活性部位氨基酸同源保守序列的比对、二级三级结构预测及分子动力学模拟进行优化，得到新的结构合理，催化机理明确的35肽序列。并利用E. coli掺入铜离子后的Cys营养缺陷型表达系统把双酶活性中心分别引入到N、C两端，制备出分子量小，透膜性好，免疫原性低，结构稳定的兼具SOD和GPx双功能酶活性的抗氧化酶。这不仅对阐明酶的催化机理以及相互间的协同作用有重要意义，而且还具有重大的药用价值。本项目的完成，势必会推动模拟酶工程研究领域的向前发展。

把具有SOD活力的17肽模拟物和具有GPx活力的15肽基因序列通过一个3肽Linker连接起来，并通过天然酶活性部位氨基酸同源保守序列的比对、二级结构预测、三级结构预测及分子动力学模拟进行优化，得到结构合理，催化机理明确的新的35肽氨基酸序列。把这段肽的基因序列连入pGEX-2T融合表达载体中，利用掺入Cu2+后的大肠杆菌Cys营养缺陷型表达系统，使目的基因表达出GPx催化基团Sec的同时，在35肽的N端3个His上螯合上SOD的活性中心二价金属Cu离子，然后经过凝血酶切融合蛋白，得到具有GPx和SOD活力的双功能小肽模拟酶Se-Cu-35P。活力测定结果表明，Se-Cu-35P的SOD活性为81 U/mg，GPx活性为56 U/µmol。我们还评估了在各个时间段凝血酶裂解对Se-Cu-35P双活性的影响，发现蛋白酶的水解会对其SOD活性造成较大影响，说明水解会影响Cu2+螯合的稳定性，但对GPx的活性影响不大。这种小分子量双功能酶的获得，可解决以往模拟物分子量大，免疫原性高，透膜性不好，不易吸收，尤其是催化机理复杂不明确的缺点，这不仅对阐明酶的催化机理，相互间的协同作用有重要意义，而且药用潜力巨大。具有极大的应用潜力。