设计具有谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶双活性位点的抗氧化协同作用的新型模拟酶

机体内抗氧化系统的平衡直接影响着人类重大疾病的发生与发展，抗氧化酶间的相互协同作用能够维持这个系统间的平衡。其中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物（GPx）之间的协同作用在这个系统中更是起着至关重要的作用，因此模拟这种协同作用对有效清除活性氧势在必行。依据天然SOD的活性部位的同源序列比对，以晶体结构更清晰的SOD3为模板，保留了其同源性最高的氨基酸序列，删除了同源性低且对活性中心没有贡献的氨基酸序列，同时插入了一段具有GPx底物GSH特异性结合位点的15肽，通过结构模拟，在特定部位引入了除GPx活性残基Sec以外的对稳定活性部位起到至关重要的氨基酸残基Gln和Trp组成催化三联体，设计具有SOD和GPx双活性部位的65肽序列，经大肠杆菌Cys营养缺陷型菌株可溶性表达后，拟获得一种具有精巧双功能结构域的新型小肽模拟酶（Se-CuZn-65P）。

作为机体内的主要抗氧化酶，超氧化物歧化酶（SOD）与谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）可以组成相互保护的防御群，发挥协同的抗氧化作用，有效的清除机体内自由基，保护细胞免遭氧化损伤，维持体内代谢平衡。本项目制备了2种具有SOD和GPX双酶活性的抗氧化肽：其一，以天然SOD中最高同源性的40个氨基酸序列和一段具有GPx活性的15肽构建成的Se-ZnCu-65P。通过单一蛋白生产（SPP）系统联合半胱氨酸营养缺陷表达法和谷胱甘肽转硫酶（GST）融合表达联合化学硒化法分别表达制备该65肽，其中SPP系统联合半胱氨酸营养缺陷表达法能大量制备纯度相对较高的Se-ZnCu-65P，节省了纯化的成本。通过实验我们发现Se-CuZn-65P能有效保护酒精对L02细胞的损伤，降低丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）的生成，抑制乙醇诱导的细胞凋亡。其二，将具有SOD活性的17肽和具有GPX活性的15肽通过3肽串联起来构建成分子量更小的Se-Cu-35P，通过GST融合表达联合半胱氨酸营养缺陷表达法制备出该35肽。通过实验我们发现Se-Cu-35P能有效保护Vc/Fe2+诱导的线粒体损伤。这不仅对阐明SOD和GPX二酶的催化机理以及相互间的协同作用有重要意义，而且还具有重大的药用价值。本项目的完成，势必会推动模拟酶工程研究领域的向前发展。