逆行性牙髓炎感染细菌的PCR-DGGE分析及蛋白质组学研究

牙周牙髓联合病变是临床治疗最棘手的疾病之一，病因复杂，疗效不稳定。本研究针对逆行性牙髓炎中牙周感染对牙髓的影响，利用基因组学和蛋白质组学技术研究逆行性牙髓炎病例牙周袋和根管内及唾液细菌学差异，通过PCR-DGGE分析,测序并构建牙周袋及根管内及唾液细菌的16S rDNA基因文库，对牙周袋和根管内及唾液细菌组成进行对比研究；采用二维高效液相色谱串联质谱（2D-LC-MS/MS）分析牙周袋和牙髓感染组织及唾液中细菌来源的蛋白质，应用SEQUEST 软件等进行生物信息学分析，筛选感染根管和牙周袋内及唾液内细菌表达的具有免疫原性的差异蛋白，探讨逆行性牙髓炎中感染优势菌的致病机理，为丰富牙周牙髓联合病变的病因学提供实验依据，并为寻求有效治疗方法提供指导。

背景：逆行性牙髓炎是临床治疗最棘手的疾病之一。本研究针对逆行性牙髓炎中牙周感染对牙髓的影响，分析感染根管内、牙周袋内细菌种类的差异性，探索优势菌及新菌种，研究优势致病菌蛋白质的差异和功能，对阐明逆行性牙髓炎的发病机理，并为采取有效治疗手段提供实验依据。.研究内容：利用基因组学和蛋白质组学技术研究逆行性牙髓炎牙周袋、根管内及唾液细菌学差异，通过PCR-DGGE分析,测序并构建牙周袋及根管内及唾液细菌的16S rDNA基因文库，并筛选优势致病菌；采用定量蛋白质组学中的相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)技术，结合纳升液相色谱和串联质谱(Nano-LC-MS/MS)方法，分析优势致病菌——牙龈卟啉单胞菌(P.g)和牙髓卟啉单胞菌(P.e)的蛋白质差异，从细菌全细胞蛋白质组角度筛选和确定P.g高毒力株特有的毒力因子，探讨P.e与P.g的不同毒力菌株蛋白组学之间的关系。.重要结果：.1.本项目发表了2篇SCI论文，6篇中文核心期刊论文；.2.培养了3名博士和2名硕士（已毕业）；.3.以本基金支持参加国际学术会议4次，投稿并参加了3次国内学术交流；.4.为本科室培养了1名青年骨干医师。.关键数据：.1. 采用PCR方法可检出牙髓内存在牙周袋感染细菌，进一步证实牙周袋内的细菌可导致牙髓感染。.2. 通过DGGE分析证明牙髓内细菌与牙周袋内细菌组成有相关性，而与唾液内细菌组成无明显相关。F.a，P.g等是逆行性牙髓炎感染的优势细菌。.3. 通过对逆行性牙髓炎牙周袋及慢性牙周炎牙周袋内细菌比较及相关性分析发现，其细菌构成差异无统计学意义，提示长期存在于深牙周袋中的细菌会随牙周病的进展进入根管而导致牙髓的感染。.4. F.a，P.g等在龈下生物膜的形成过程中起到重要作用，同时检出率很高。.5. 将iTRAQ与Nano-LC-MS/MS相结合用于比较细菌蛋白质组学研究，可以得到较全面的蛋白质定性和定量数据。P.g W83内高表达和特殊表达的蛋白主要是侵袭力相关蛋白，具有结合和代谢功能的蛋白等。.6. P.e ATCC35406内表达的RagA、脂蛋白等可能是P.e ATCC35406潜在的毒力因子，推测P.e的致病能力和P.g W83更为接近。.科学意义：本研究探讨了逆行性牙髓炎中感染优势菌的致病机理，为丰富牙周牙髓联合病变的病因学提供实验依据，并为寻求有效