Nucleolin介导EMMPRIN信号传递并参与小鼠下颌磨牙牙胚形态发生机理的研究

牙齿再生研究的首要前提在于充分明确那些与牙齿发生发育相关的重要基因及其相互关联。本研究的目的旨在揭示nucleolin与EMMPRIN在牙胚上皮、间质相互作用中的关联，从而进一步了解小鼠磨牙牙胚形态发生这一复杂过程。nucleolin是细胞核仁内一种与核糖体发生及细胞增殖相关的重要蛋白。前期研究显示，nucleolin的表达缺失可导致EMMPRIN下游MMPs的表达下调从而影响小鼠磨牙造釉器正常的形态发生。为此本实验将在前期研究的基础上，针对EMMPRIN在牙胚中的表达定位，功能作用及作用机理这三方面开展研究，通过运用原位杂交、免疫组化、器官培养及基因沉默等实验方法及手段来探讨EMMPRIN 在牙胚形态发生过程中的特异性和重要性，揭示EMMPRIN与nucleolin相互作用的生物学机理，从而进一步明确EMMPRIN与nucleolin所参与的信号通路在牙胚形态发生过程中的重要作用。

我们对EMMPIRN在牙胚发生发育过程中的表达进行了定量、定位、定性方面的研究。首先通过提取各阶段小鼠下颌磨牙牙胚中的全长mRNA并通过使用real-time PCR的检测方法，明确了EMMPRIN mRNA 的转录水平在小鼠牙胚发生发育的各个阶段直至出生后都呈现出一种经时性的递增趋势；其后，通过使用原位杂交和荧光免疫组化的方法分别检测了EMMPRIN和nucleolin在牙胚发生初期、蕾状期、帽状期、钟状期以及出生后的分泌期中mRNA和蛋白的表达定位情况；为了研究EMMPRIN在牙胚发育过程中的功能作用，在体外进行的E11.0小鼠下颌的器官培养中，通过使用EMMPRIN siRNA对EMMPRIN的表达进行了干扰，结果显示，与对照组相比，在siRNA的干扰下牙胚的成形发育受到了显著的影响，同时，在EMMPRIN被阻断后其下游的MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP13、MT2-MMP mRNA的表达受到了下调，然而，MT1-MMP mRNA的表达却发生了显著的上调。为了进一步了解EMMPRIN在牙胚发生过程中的作用，我们通过使用EMMPRIN特异性抗体，在体外培养的E15.0和E18.0的牙胚中封闭了EMMPRIN的表达活性。实验结果显示在EMMPIRN的蛋白活性被阻断后，成釉细胞和成牙本质细胞的分化成熟受到了影响，牙胚的细胞外基质的分泌尤其是牙釉质的矿化形成受到了阻碍，与细胞外基质合成相关的MMP9, MMP13, MMP20, ALPL, ameloblastin, amelogenin及enamelin mRNA的表达受到了抑制。由此可见，EMMPRIN作为一个重要的因子在小鼠磨牙牙胚的发生发育过程中通过调节其下游MMPs的表达参与了牙胚细胞外基质的改建、分泌以及矿化等过程。 最后，在现有的实验基础上，我们还对成体（人和狗）的牙周组织内的EMMPRIN的表达情况进行了进一步的检测，通过使用ELISA和real-time PCR的方法分别定量检测了EMMPRN在牙周炎以及种植体周围炎的发生发展过程中EMMPIN在龈沟液以及牙龈组织内的mRNA和蛋白的表达变化，其结果发现，EMMPRIN的表达水平与牙周炎的发生发展呈正相关，而与种植体周围炎的发展呈经时性的负相关。