红掌WOX基因分离及其调控芽和体胚再生的功能解析

in vitro cultured somatic cells of Anthurium andraeanum have the capacity to regenerate into a new plantlet undergo shoot organogenesis or somatic embryogenesis. However, the poor regenerated frequency and asynchronous of somatic embryo hampers its application in propagation. The destiny and regeneration passways of stem cells is determined during the transition of somatic cells to totiptent callus, which is a complicated process with limited knowledge. In recent research, distinct expression domains of WOX gene family members are involved in specifying stem cell fate and patterning of the early embryo in Arabidopsis. Therefore study of the regulated role of WOX genes in Anthurium andraeanum will benefit our understanding of the mechanism during in vitro regeneration. In this study, organogenic callus, embryogenic callus, and non-embryogenic callus were generated from in vitro cultured root-tip of Anthurium andraeanum, which is an important flower breed in Araceae. The WOX gene family wound be isolated and identified through high-throughput transcriptome sequencing, homologous cloning and RACE technique. The expression pattern in different developmental stages and tissue domains will be detected by qRT-PCR and In situ Hybridization Histochemistry (ISHH). Also, the function of WOX will be studied by reversed genetics using Agrobacterium-mediated transformation. The aim of this study is to identify WOX gene family in Anthurium andraeanum, analyze the regulated role of WOX involved in organogenesis and somatic embryogenesis, which will highlight the way to reveal the complex molecular mechanism behind the occurrence and differentiation of totipotent callus in Anthurium andraeanum.

红掌离体再生可通过芽和体胚两种途径，但体胚发生数量及同步化程度较低，限制其在生产上的应用。植物体细胞向全能性愈伤转变的过程决定了干细胞分化命运及再生方式，目前对该生物学过程中调控机制的研究很有限。其中一类转录因子WOX的组织特异性表达，决定了细胞分化命运和胚胎形态建成，因此对红掌WOX基因家族的功能解析有助于理解再生过程的调控机制。本研究以天南星科重要观赏花卉红掌为实验对象，通过根尖培养获得器官性愈伤，胚性愈伤和非胚性愈伤，采用转录组高通量测序技术，同源基因克隆和RACE技术分离并鉴定红掌WOX基因家族，通过qRT-PCR和原位杂交研究基因在愈伤不同发育阶段和组织空间的表达规律，并采用农杆菌介导的遗传转化技术，通过反向遗传学研究红掌WOX的基因功能。目的在于鉴定红掌芽和体胚再生的关键WOX基因，并探索其调控机制，为研究红掌全能性愈伤发生和分化的复杂分子调控机制提供参考。

植物离体再生的关键阶段是已分化的体细胞重新编码获得全能性干细胞的过程，其中涉及到诸多基因的差异表达和复杂的分子调控网络。我们在红掌离体再生的研究中发现，根尖培养能够形成两种类型的愈伤组织，两者具有不同的分化命运，可应用于研究干细胞启动和命运决定的实验材料。本项目开展了以下研究：.（1）两种愈伤形态，以及不定芽发生和体细胞胚发生过程的形态学研究。结果表明成芽愈伤和胚性愈伤存在组织和细胞学水平的差异，从而导致不同的细胞分化命运。在不定芽发生途径中，首先形成白色至乳白色、结构致密的愈伤组织，愈伤内部具有多个拟分生组织中心，为典型的器官性愈伤。在体细胞胚发生途径中，首先形成黄色、松散状愈伤组织，继代后转接到体胚发生培养基上，可以实现体细胞胚的大量发生，同时可观察到球形胚、盾形胚、子叶胚。.（2）通过转录组测序研究愈伤发育过程中的差异表达基因，结果表明，差异基因主要涉及到生长素、细胞分裂素、乙烯、油菜素内酯生物合成和信号转导。此外，我们的研究表明愈伤的发生受到SNP处理的促进，而被rac-GR24处理所抑制。.（3）采用全长转录组测序和PCR技术获得7个红掌WOX基因的全长片段，并进行了测序验证。通过分子进化树构建表明7个红掌WOX基因家族成员可聚类到3个分支。对WOX基因的表达模式分析表明，AAW3，AAW5和AAW6在胚性愈伤中的表达量均显著高于其他组织，提示这3个基因成员可能与红掌的胚性愈伤组织的诱导高度相关。.（4）红掌AAW3表达载体构建及遗传转化研究。通过优化的农杆菌介导红掌胚性愈伤的遗传转化体系，获得11个抗潮霉素抗性愈伤，其中一个愈伤表现为GUS染色阳性。对获得转基因阳性愈伤进行继代培养，发现其增殖能力比对照强。.本项目通过优化农杆菌介导红掌胚性愈伤的遗传转化，为今后红掌的分子改良和功能基因研究奠定基础。首次对红掌的WOX基因家族成员进行分离克隆，进一步分析表明AAW3可能参与红掌胚性愈伤的调控，为红掌胚性愈伤的分子调控提供依据。