牡丹PsSERK基因在体胚发生过程中的功能解析

The indirect regeneration system of somatic embryo was not establish on the tissue culure of tree peony. We found it was difficult to transform from non-embryogenic callus to embryogenic callus that was the key factor limited to build the somatic embryo regeneration system of tree peony, and got the PsSERK gene（KF876175）associated with embryogenic callus formation, and also preliminary built the callus genetic transformation system of tree peony. The aim of our project was to identify the function of PsSERK. Therefore, the genetically modified system of tree peony, the PsSERK over-expression and RNAi transformation organization will be constructed. Temporal and spatial expression patterns of PsSERK will be study for revealing its specific expression or not and basic function in the process of tree peony somatic embryo formation by real-time quantitative PCR technology system, and its action site also would be clear. The change of endogenous hormone GA3, ABA and related enzymatic activity of transformation organization and control (CK) were study, with the somatic embryo formation conditions, to expound the relationship of hormone, enzymatic activity and morphological change induced by SERK gene, and its molecular mechanism was also defined. The study will provide theoretical and technical support for exploring the molecular regulation mechanism on adventitious root formation and establishing an efficient in vitro regeneration system of tree peony.

目前，在牡丹组织培养研究方面尚未建立稳定的体胚间接再生体系。课题组前期研究发现非胚性愈伤向胚性愈伤转化难是限制牡丹体胚再生途径建立的关键因素，并获得可能与其发生能力相关的PsSERK（KF876175）基因全长，初步构建了牡丹愈伤组织遗传转化体系。本研究拟构建牡丹愈伤组织转基因体系及PsSERK的过量表达组织和RNAi抑制表达组织；通过实时荧光定量PCR技术，研究该基因在胚性愈伤组织诱导过程中的时空表达模式，初步揭示其是否在体胚发生过程中特异性表达及基本功能，并明确其作用部位；研究转化愈伤组织和对照中的植物内源GA3和ABA的变化规律及相关酶活性的表达变化，并结合胚性愈伤组织形成情况，阐明牡丹体胚发生过程中SERK基因诱导的形态改变与激素、酶活性变化之间的联系；最终明确该基因在牡丹体胚发生过程中的分子机制。上述研究将为探寻牡丹体胚发生分子调控机制、建立高效体胚再生体系提供理论和技术支撑。

本试验以牡丹品种‘凤丹白’的愈伤组织为材料，提取RNA，通过PCR扩增的方法成功获得了牡丹PsSERK基因全长，并根据对PsSERK全长序列的分析，结合载体结构分析，构建了含有牡丹PsSERK基因的pHBT-PsSERK-GFP融合蛋白瞬时表达载体，通过拟南芥叶原生质体亚细胞定位，发现牡丹SERK蛋白质在细胞质中的表达分布。优化了农杆菌介导的牡丹愈伤组织遗传转化体系，确定了对农杆菌LBA4404除菌效果较好的是Cb，且适宜浓度为200 mg•L-1；构建了PsSERK干扰表达载体pCAMBIA1300-PsSERK-psgR-Cas9-At，并将其过量表达载体和干扰表达载体通过农杆菌介导转入牡丹愈伤组织中，以添加外源细胞分裂素类物质 6-BA（0.5 mg•L-1）、TDZ（0.1 mg•L-1）的未转基因愈伤组织（对照）为研究对象，分别在 0，5，10，15，20，25，30，35，40，45 d采集上述三处理的愈伤组织，进行相关的激素（ABA、GA3、IAA），酶活性（POD、SOD、APX、CAT）等指标的测定以及实时荧光定量，结果表明，三种处理的牡丹愈伤组织的PsSERK 基因表达量由高到低排序依次是：过量>未转基因（对照）>干扰，且均在30 d达到最高值。PsSERK基因在牡丹体胚发生过程中的酶代谢和激素表达上都有重要作用，推测在培养的20-25 d可能开始出现胚性细胞，25-35d可能出现大量胚性细胞。同时将PsSERK干扰表达载体转入野生型拟南芥，发现PsSERK基因干扰表达使得拟南芥根系发育不良，短小，植株表现出生长缓慢，开花延迟特征。这些研究对揭示牡丹早期体细胞胚胎发生的分子机制起着重要作用, 同时为探究PsSERK基因及其他相关基因在牡丹体胚发生过程中的调控机理及其功能提供依据。