利用化学小分子替代外源基因制备转分化诱导肝样细胞（iHEPs）的研究

Liver transplantation is an effective therapeutic approach for end-stage liver diseases, however, the shortage of liver donors hampers its’ clinical application. Hepatocyte transplantation can be used as an alternative treatment to liver transplantation, but the available primary hepatocyte resources still could not reach the requirement. Direct cell trans-programming can provide a potential and sufficient autologous induced hepatocyte-like cells (iHEPs) resources. Unfortunately, the potential risk of genomic interrupt induced by viral systems and exogenous genes will restrain the clinical application of iHEPs. In this project, we will improve and optimize the method of iHEPs generation using small chemical molecules to establish safe iHEPs for clinical application. Our group has initially screened nine chemical small molecules with the potential of activating iHEPs trans-programming, and seven small molecules which can maintain the characteristics of mature hepatocytes. In this research, we will perform further screening and optimization to select the optimum chemical molecule combination, which can completely replace the exogenous genes to generate safe and quality iHEPs for clinical application.

肝移植是目前临床治疗终末期肝病的主要手段，但由于供体肝脏资源短缺导致大量患者无法得到及时有效的救治。肝细胞移植可作为肝移植治疗的一种替代手段，细胞直接转分化技术能够为肝细胞移植治疗提供充足的患者自体诱导肝样细胞（iHEPs）。但是目前该技术所使用的随机整合外源基因会导致潜在的致癌风险，本课题将改进、优化建立iHEPs的方法，利用化学小分子制备无生物安全隐患、可供临床应用的iHEPs。在前期工作中，本课题组已建立了两个候选化学小分子库和报告细胞系，并已筛选出了9种具有激活iHEPs转分化潜能和7种能够维持成熟肝细胞特性的化学小分子。在本课题中将对候选库中的化学小分子进行进一步的筛选和优化，建立利用化学先分子完全替代外源基因制备高质量iHEPs的策略，并对其的临床应用潜能进行验证。本研究将为iHEPs应用于终末期肝病的临床治疗奠定基础，并为下一步实现体内药物逆转肝纤维化和肝硬化的研究提供数据。

本研究利用肝细胞特异性启动子驱动的荧光报告基因细胞系，对化学小分子在诱导类肝细胞（iHEPs）转分化过程中的应用和作用机制进行了研究。我们筛选出4种化学小分子的组合（A83-01、CHIR99021、Brdu、WS-242，记为CM4）可以有效的提高HNF4a单因子诱导的iHEPs的转分化效率，同时筛选出2种化学小分子组合（FH1、FHP2，记为CM2）可以促进HNF4a单因子诱导的iHEPs细胞向更靠近成熟肝细胞的方向分化。通过化学小分子的应用，可以使HNF4a单因子诱导的iHEPs达到与4因子诱导iHEPs相近的转分化效率和功能水平，这为减少外源基因的定植、提高iHEPs的安全性提供了支持。同时我们也证实仅使用化学小分无法有效地将成纤维细胞诱导转分化为成熟的iHEPs细胞，证明CM2在启动细胞命运想肝实质细胞转分化的能力不足，miRNA-221-3p，miRNA-125b-5p和miRNA-199a-5p可以辅助化学小分子，但是仍然无法达到去除外源因子应用的水平。我们对肝纤维化患者肝脏的内源环境进行了分析，发现IL-1b和TGFb是促进肝纤维化进展的关键因素，同时利用构建的纳米材料3D肝芽在体外进行了验证。利用3D肝芽体外筛选系统我们对化学小分子组合CM4、CM2进行了体外验证确认了其发挥抑制肝纤维化功能的潜力。更重要的我们开发的纳米材料3D肝芽构建技术可以为进一步研究iHEPs的体内转分化和治疗肝纤维化提供高效、经济的研究平台。