Nrf2-ARE通路在缺血/药物后处理中作用的研究

缺血后处理可促进活性氧（ROS）适量释放，ROS是调控Nrf2的重要信号分子，缺血后处理可能通过ROS调控Nrf2-抗氧化反应元件（ARE）通路，诱导细胞内源性抗氧化产物的表达，对缺血心肌产生保护作用。那么，用药物替代缺血进行后处理能否模拟出缺血后处理样的心肌保护效果？能否在再灌注前促进适量ROS爆发性的释放，以触发Nrf2-ARE抗氧化途径的活化对抗再灌注期间大量ROS对心肌的损伤，将是本课题研究的重点。本课题拟采用离体大鼠心脏缺血再灌注模型和成年大鼠心肌细胞缺氧复氧模型，观察缺血、吡那地尔（Pinacidil）及乳化异氟醚后处理对大鼠心肌组织和细胞的保护作用，并探索Nrf2-ARE通路在三种后处理方式对心肌保护机制中的作用，三种后处理方式对Nrf2-ARE通路的激活机制，以及药物替代缺血后处理的可能性，为临床抗心肌缺血再灌注损伤提供新的理论依据和更便利的方法，为新药的开发奠定实验基础。

本课题在既往对缺血预处理、药物预处理、抗心肌缺血再灌注炎性反应的基础上，以Nrf2为靶点，探讨后处理心肌保护的机制，以及药物替代的可能性。通过建立大鼠Langendorff离体心脏缺血再灌注(IRI)损伤模型及成年大鼠心肌细胞缺氧复氧模型，观察大鼠离体心脏功能、电镜观察心肌超微结构及线粒体评分、荧光共聚焦显微镜观察复氧末心肌细胞内钙，明确缺血后处理、吡那地尔(Pinacidil)后处理以及乳化异氟醚(EI)后处理的心肌保护效果及以药物后处理替代缺血后处理的可能性；分别采用RT-PCR和 Western blotting方法检测各组心肌组织及细胞中Nrf2、醌氧化还原酶（NQO1）、超氧化物歧化酶1（SOD1）及血红素加氧酶1（HO-1）基因mRNA转录及蛋白质表达的情况，荧光共聚焦显微镜观察Nrf2核转位情况，探讨Nrf2-ARE通路在三种后处理对缺血缺氧心肌保护中的作用；采用ELLISA法检测缺血后处理、两种药物后处理（不同浓度Pinacidil、不同浓度EI ）以及脂肪乳对照组心肌组织及细胞中的活性氧(ROS)水平，明确上述后处理方式诱发的活性氧水平是否与心肌保护效果有关；应用活性氧清除剂MPG处理，观察Nrf2及通路下游产物的mRNA及蛋白表达量和其余指标的变化，探讨三种后处理对Nrf2-ARE通路激活的可能机制。上述工作均已完成，部分结果还在整理统计中。从完成的实验结果可得出以下结论：缺血后处理能改善缺血心肌组织和细胞结构及功能，其心肌保护机制可能是激活了Nrf2-ARE通路，激活Nrf2-ARE通路可能是缺血后处理的心肌保护机制之一；Pinacidil、EI后处理能模拟缺血后处理的心肌保护作用，改善心肌组织和细胞结构与功能，减轻细胞内钙超载；Pinacidil、乳化异氟醚后处理均可诱导Nrf2核转位并诱导其下游抗氧化蛋白和二项解毒酶基因和蛋白质的表达上调，激活Nrf2-ARE通路可能是这两种药物后处理的心肌保护机制之一；缺血、Pinacidil以及EI后处理过程诱导产生的小剂量活性氧可能是激活Nrf2-ARE通路的关键所在，且他们诱发的活性氧水平与心肌保护效果相关。本实验结果将有助于揭示后处理的心肌保护作用机制，为寻找药物后处理的作用靶点提供实验依据，为临床抗心肌缺血再灌注损伤提供新的理论依据，为新药的开发奠定实验基础。