一株侧孢短芽孢杆菌产生的抗菌肽结构鉴别及其对苹果轮纹病菌细胞的作用研究

Fungal diseases seriously threaten the apple production of China, which cause heavy economic losses every year. Looking for the biological control measures of these diseases is of great economic and environmental significance. Brevibacillus laterosporus ZQ2 is an antagonistic bacteria isolated from orchard soil (Genbank No.EU471747). This strain has great development potential as a biological agent for its good antagonistic activities against variety of pathogenic fungi in apple, excellent fermentation traits, steady colonization ability and stable antimicrobial peptides. Previous studies have demonstrated that there are one or two new peptides which are not reported in the antifungal active substances produced by strains ZQ2.This study plans to isolate and purify the antifungal peptides of strain ZQ2 by the methods of salting out, organic solvent extraction, ion exchange column chromatography and high performance liquid chromatography. It intends to elucidate the structure and physicochemical properties of each active peptide by UV, IR spectroscopy, mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy analysis. The study also plans to clarify the targets and mode of action of the active peptides on Botryospuaeria berengeriana cell, in order to provide a theoretical basis for the further development of the strains and its antifungal substances.

果树连作引起的真菌病害积累严重威胁我国苹果生产，每年造成大量经济损失，寻找其生物防治手段具有重大经济和环保意义。侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus) ZQ2是从果园土壤分离获得的拮抗菌（GenBank注册号EU471747）。前期研究表明该菌株对苹果多种病原真菌均有良好的拮抗作用，且菌株发酵性状优异，其产生的抗菌肽性质稳定，菌株定殖能力强，防效突出，极具研发潜力。前期研究已证实ZQ2菌株产生的抗菌肽中有1-2种未报道的新物质。本研究拟采用盐析、有机溶剂抽提、离子交换柱层析及高效液相色谱等方法，分离、纯化抗菌肽的各组分；运用紫外、红外光谱、质谱、核磁共振谱等手段，探明抗菌肽各组分的结构与理化性质；运用荧光标记、分子探针标记、电镜显微观察等技术，阐明抗菌肽对苹果轮纹病菌细胞的主要作用靶点与作用方式，以期为进一步开发该菌株及其抗菌肽提供理论依据。

苹果树连作障碍广泛分布于世界各地的苹果产区，造成严重的经济损失。研究发现，生物因素是造成连作障碍的主要原因。从自然环境中筛选得到能够有效抑制果树病原菌生长的微生物来防治连作障碍是当前该领域研究的一大热点。ZQ2菌株是从苹果园土壤中分离获得一株高效拮抗细菌，抗菌谱广泛，活性物质发酵性状优良。本研究对该菌株产生的抗菌活性组分进行了分离纯化和结构鉴别，研究了主要组分对苹果轮纹病菌细胞的主要作用方式，并获得了该菌株的全基因组序列，分析了与抗菌物质合成有关的主要功能基因。. （1）ZQ2菌株的发酵液经硫酸铵盐析、甲醇抽提、CM Sepharose FF离子交换柱层析、甲醇抽提后，经RP-HPLC分析和制备，获得纯度和数量均达到化学结构测定的要求2个抗真菌活性组分F1和F2. （2）F1、F2属于多肽类抗生素，采用ESI-MS法测定的F1、F2组分的相对分子量为1556Da左右。结合质谱、核磁共振谱（1HNMR、13CNMR、gCOSY、gHMQC、gHMBC）解析，确定F1为一种线性脂肽类抗生素，氨基酸序列为Hmp-Aba-Val-Orn-Val-Val-Val-Lys-Val-Leu-Lys-Tyr-Leu-Vol。. （3）抗真菌活性组分的性质较为稳定，对热、酸碱、紫外线以及蛋白酶K均不敏感。ZQ2菌株产生的抗真菌活性组分的抑菌谱较广，对多种植物病原真菌均具有较强的抑制作用。. （4）ZQ2菌株产生的F1组分对苹果轮纹病菌的细胞壁、细胞膜等部位均有作用靶点，可破坏其结构，改变细胞通透性，造成细胞内容物外泄，进而达到抑制其生长，并杀死病菌细胞的作用。. （5）测序获得了ZQ2菌株的完成图序列。分析得到了ZQ2菌株基因组的全长、编码区长度、编码基因数量、基因组GC含量等数据。利用GO、KEGG、COG、NR、Pfam和Swiss-Prot通用功能数据库对基因组进行了注释，系统分析了基因产物在细胞中的代谢途径及其功能，通过编码蛋白系统进化关系分类推测了直系同源序列的功能，对基因信息进行了物种注释分类，对主要基因的蛋白质功能和结构等进行了高水平注释。. 项目研究过程中还发现ZQ2菌株对苹果幼苗有良好的促生效果，并可改良土壤环境，可作为产品深入开发。本项目研究为ZQ2菌株及其抗菌组分的应用提供了理论依据和技术支持。