侧孢短芽孢杆菌经龙胆酸分解代谢4-羟基苯甲酸及其NIH迁移的分子机理研究

An NIH shift is a chemical rearrangement where an atom (or a group) on an aromatic ring undergoes an intramolecular migration primarily during a hydroxylation reaction catalyzed by an enzyme. However, the mechanism study of this interesting observation is very limited. Brevibacillus laterosporus PHB-7a degrades 4-hydroxybenzoate via gentisate pathway involving an NIH shift. But to date, neither the 4-hydroxybenzoate catabolic genes nor the corresponding enzymes have been identified in any microbial strains. In this proposed study, the complete 4-hydroxybenzoate catabolic gene cluster in strain PHB-7a will be identified by genome sequencing together with transposon mutagenesis. The physiological and biochemical functions of catabolic genes involved in this pathway will be characterized through gene knockout and complementation, expression in vitro, product identification and enzyme assays. The functions and properties of the key enzymes involved in the NIH shift will be investigated in great details. The findings from this study will hopefully reveal, for the first time, the pathway for 4-hydroxybenzoate catabolism via gentisate involving an NIH shift at molecular, biochemical, and genetic levels. In particular, the mechanism of NIH shift will also be elucidated. It is also of great help to explore the catabolic diversity for the microbial aromatic degradation and illustrate the adaptive evolution strategies of microbes in their catabolism.

NIH迁移是酶催化苯环上羟化反应时一种分子内的重排现象，多种芳烃代谢过程中伴随着NIH迁移，但对其机理研究甚少。侧孢短芽孢杆菌PHB-7a通过伴有NIH迁移的龙胆酸途径将4-羟基苯甲酸彻底降解，但该代谢途径在任何微生物菌株中无遗传和生化水平的研究报道。本研究拟以侧孢短芽孢杆菌PHB-7a为研究对象，通过基因组测序、转座子插入突变等方法获得完整的4-羟基苯甲酸代谢基因簇，结合基因敲除互补、体外表达、酶活测定和产物鉴定等方法鉴定其生理学和生化功能；纯化代谢途径中NIH迁移的关键酶，进行酶学特性研究。本研究将首次从分子生物学、生化和遗传学水平上阐明微生物代谢4-羟基苯甲酸时伴随羧基NIH迁移的龙胆酸途径，并揭示NIH迁移的分子机理，进一步阐明微生物分解代谢的多样性及其适应性进化策略。

NIH shift是酶催化苯环上羟基化反应时引起的一种基团分子内迁移的现象，该现象在哺乳动物的疾病、药物代谢、抗生素合成以及芳香化合物的降解中均有发现。可以发生NIH shift的基团包括氢原子、卤素、乙酸、烷基以及羧基等。其中，氢原子和乙酸基团的迁移是由单个加氧酶催化完成，并有相关基因和酶学的报道，但其它基团包括羧基等的机理尚未阐明。羧基的分子内迁移主要发现于微生物的对羟基苯甲酸（para-hydroxybenzoate, PHB）有氧分解代谢中。PHB主要通过木质素的降解被释放到环境中，其与植物病原菌的致病性有一定的关系，并且可以作为碳源被自然界中的许多微生物所利用。迄今为止，PHB的微生物代谢研究已经取得了很多进展，其有氧代谢主要包括原儿茶酸和对苯二醌途径，此外还包括涉及羧基分子内迁移的龙胆酸（2,5-二羟基苯甲酸，gentisate，GA）途径。前两条代谢途径的分子机制已经研究清楚，但微生物通过GA代谢PHB的途径从发现至今依然没有基因和酶学等相关报道。Brevibacillus laterosporus PHB-7a通过GA分解代谢PHB，本项目通过转录组分析发现了该菌株中PHB代谢的完整编码基因，通过分子生物学和酶学研究对编码基因逐个进行功能验证。其中基因簇phgABC编码转化PHB生成GA的蛋白，以稳定性同位素标记的PHB(2, 3, 5, 6-tetradeutero-PHB and [carboxyl-13C]-PHB)作为转化底物，通过对产物的分析，证明了PHB的羧基分子内的迁移和保留。PhgA，PhgB，PhgC分别为对羟基苯甲酰辅酶A羟化酶，龙胆酰辅酶A硫脂酶和对羟基苯甲酰辅酶A连接酶。另一个基因簇bagILK编码通过异构途径代谢GA的蛋白，BagI、BagL和BagK分别为龙胆酸1,2-双加氧酶，依赖于L-半胱氨酸的顺丁烯二酸单酰丙酮酸丙酮酸异构酶和反丁烯二酸单酰丙酮酸水解酶。.本项目首次从基因和酶学水平详细阐述了羧基分子内迁移的分子机理，发现羧基分子内迁移的反应机理较之氢原子和乙酸基团的迁移要复杂很多，揭示了PHB中羧基分子内迁移的本质其实是p-hydroxybenzoyl-CoA羟基化反应时引起的酰基辅酶A（acyl-CoA）的迁移。羧基分子内迁移模式的发现揭示了硫酯化合物在生物化学过程中新的作用，也揭示了微生物代谢芳香化合物的多样性。