硝酸甘油持续作用促进肌球蛋白轻链磷酸酶调节亚单位MYPT1蛋白降解导致耐受形成的机制研究

硝酸甘油是临床上治疗心血管疾病的一种常用药物，但其长期使用所产生的耐受严重影响了其使用和疗效。我们最近工作发现硝酸甘油持续作用可以降低血管平滑肌中肌球蛋白轻链磷酸酶调节亚单位MYPT1的蛋白含量，从而降低该酶的活性导致耐受形成。基于预实验结果我们提出假说：硝酸甘油持续作用时，通过环鸟苷酸依赖的蛋白激酶的介导，促进泛素连接酶SIAH2与MYPT1的结合，导致MYPT1发生泛素依赖的蛋白降解；通过抑制SIAH2的活性，可阻断MYPT1的降解改善NTG耐受。针对该假说我们拟明确：①环鸟苷酸依赖的蛋白激酶促进MYPT1降解的作用机制；② SIAH2在MYPT1降解中的作用；③ 抑制SIAH2对NTG耐受的改善情况。我们拟在离体组织、细胞和整体水平，使用生化与分子生物学实验方法，结合血管功能测定等手段进行验证，期待为硝酸甘油耐受形成机制提供新的认识，为临床防止或改善硝酸甘油耐受提供新的线索。

硝酸甘油是临床上治疗心血管疾病的一种常用药物，但其长期使用所产生的耐受严重影响了其使用和疗效。本项目紧密围绕硝酸甘油舒张血管的作用机理以及其耐受形成的机制为中心展开研究。我们之前的工作表明可溶性鸟苷酸环化酶（soluble guanylyl cyclase，sGC）和环鸟苷酸依赖的蛋白激酶（cGMP-dependent protein kinase，PKG）在硝酸甘油引起冠状动脉中起着重要作用；硝酸甘油持续作用可以通过降低PKG的mRNA、蛋白水平降低其活性，并且还可以通过PKG依赖的方式降低其下游靶蛋白肌球蛋白轻链磷酸酶调节亚单位MYPT1的蛋白含量来抑制该酶的活性，从而导致硝酸甘油耐受的形成。在本计划的资助下，我们研究发现5型磷酸二酯酶是磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶Akt信号通路下游的一个新靶点，通过抑制该信号通路可以特异性增强硝酸甘油引起的猪冠状动脉舒张，这在已发生耐受的血管上同样有效，可能为改善硝酸甘油耐受提供新思路；我们还发现氧化还原应激可通过改变sGC与PKG的单聚体与双聚体之间的动态平衡从而影响硝酸甘油和一氧化氮引起的血管舒张；同时发现，PKG-MYPT1信号通路的差异可能是不同直径血管对硝酸甘油等硝基类舒血管反应存在差异的机制之一；最后我们通过生物信息学预测了可能调节sGC表达的miRNA,并通过实验验证miR-34c-5p可以调节该酶β1亚单位的表达,并且发现缺氧可以通过转录因子sp1来调节miRNA-34c-5p,进而影响肺血管平滑肌细胞中sGC β1亚单位的表达水平。