再生神经肌肉接头调控喉肌成肌干细胞分化融合的信号分子机制

神经肌肉接头重建和成肌干细胞分化融合修复受损肌纤维是失神经骨骼肌再生和功能恢复的关键。申请人及文献证实神经修复的运动终板乙酰胆碱受体（AchR）功能状态与喉肌功能恢复有关，神经再生可激活成肌干细胞上调成肌因子的表达，但机制不明。本项目拟通过Nestin-GFP转基因小鼠喉返神经再生模型，干预AchR功能前后，研究喉肌细胞内钙离子依赖型信号分子calpain、M-cadherin等表达和分布改变及成肌细胞分化融合程度；再采用神经-肌肉-成肌细胞共培养、AchR功能干预、组成型激活/失活等方法，研究喉肌细胞、成肌细胞内钙离子浓度和分布，钙离子依赖型信号分子表达、活性和分布及成肌细胞分化融合程度；阐明神经再支配调控成肌干细胞分化融合的确切分子作用机制，再生乙酰胆碱受体调控成肌细胞分化融合的确切信号转导机制。为失神经喉肌等骨骼肌再生机制研究和干预神经肌肉再生关键分子事件提供新的治疗策略和理论依据。

本项目旨在探讨神经修复后的再生神经肌肉接头调控成肌细胞分化融合的作用及可能信号转导机制。为此，我们首先构建了小鼠骨骼肌失神经支配及神经再支配的动物模型，观察到（1）失神经支配阶段，骨骼肌卫星细胞（成肌细胞）发生代偿性增殖分化以修复骨骼肌纤维。（2）神经再支配阶段即再生的神经肌肉接头逐渐形成并成熟过程中，AchR表达量逐渐上调，分化的成肌细胞显著增多。表现为成肌调节因子myogenin持续表达上调；而采用Botox特异性阻断再生的神经肌肉接头，分化的成肌细胞数目和myogenin表达程度明显低于未阻断组。（3）失神经支配阶段的ERK1/2磷酸化水平增高；在神经再支配过程中，ERK1/2磷酸化水平逐渐下降至正常水平。Botox特异性阻断后ERK1/2磷酸化水平持续增高。在体实验结果提示，神经修复后重建的神经肌肉接头，逐渐成熟并聚集的AchRs，通过上调成肌调节因子的表达，促进成肌细胞的分化融合和骨骼肌纤维的再生，其作用机制可能是通过ERK1/2信号通路。我们又通过建立并采用原代运动神经元-C2C12成肌细胞共培养体系，探讨再生神经肌肉接头调控成肌细胞分化融合的作用机制，观测到（1）神经肌肉接头形成过程中，运动神经元末梢释放聚集素agrin，促进肌管AchRs表达和聚集。（2）随着AchRs的逐渐成熟，成肌调节因子myogenin和肌球蛋白重链MyHC表达上调，分化的成肌细胞增多。采用α-BTX特异性阻断肌管AchRs，下调myogenin和MyHC的表达，分化成肌细胞数目减少，与未加阻断剂组比较，差异有统计学意义。（3）肌管AchRs成熟过程中，ERK1/2磷酸化水平逐渐上调，同时细胞内M-cadherin表达也上调；而给予EGF上调ERK1/2磷酸化水平，下调M-cadherin表达，抑成肌细胞分化。（4）流式细胞学检测细胞内游离钙离子浓度变化，各组间的差异无统计学意义。离体实验证实，神经肌肉接头形成后逐渐成熟的AchRs，通过下调ERK1/2磷酸化水平，上调M-cadherin的表达，促进成肌细胞的分化融合；并且钙离子依赖的信号转导可能未参与AchRs调控成肌细胞分化融合的作用机制。因此，本课题证实再生神经肌肉接头促进成肌细胞分化融合的作用，其机制是AchRs的激活通过非钙依赖信号通路，下调ERK磷酸化水平，上调细胞内M-cadherin表达，促进成肌细胞分化融合。