UDP/P2Y6信号通路调控成肌干细胞迁移对失神经喉肌再生的作用

喉返神经修复可使喉肌再生，但喉肌结构和功能仍难以恢复正常，重要原因是成肌干细胞的功能受损。作为喉肌再生的源泉，成肌干细胞向受损区域迁移是肌肉再生过程的关键环节。嘌呤能受体P2不同亚型的时空差异性表达对成肌干细胞功能调控有其独特的作用，申请人已证实骨骼肌再生过程中，成肌干细胞P2Y6表达上调并呈特异性的极性分布；并进一步证实UDP特异性激活P2Y6可显著提高成肌细胞迁移能力，据此推测UDP/P2Y6可能通过调控成肌干细胞迁移促进肌肉再生，但确切机制尚不清楚。本课题拟通过基因转染、药物干预和组成型激活/失活技术，阐明UDP/P2Y6调控成肌干细胞迁移的作用和信号转导机制；并在体研究阐明UDP/P2Y6对失神经喉肌再生的作用。从分子、细胞和组织等多水平，揭示UDP/P2Y6信号通路调控成肌干细胞对失神经喉肌再生的作用及机制，为促进失神经喉肌等骨骼肌的再生和功能恢复，提供新的治疗思路及理论依据。

成肌细胞是骨骼肌的种子细胞，其数目和活性决定了骨骼肌发育和再生的程度。课题组前期阐明了小鼠骨骼肌发育和损伤再生过程中嘌呤能受体P2Y6的时空表达呈特异性的细胞极性分布和一过性的上调，提示P2Y6受体激活可能参与了成肌细胞和肌管的细胞骨架运动的调控，具体作用机制尚不清楚。为此，本项目本课题拟通过基因转染、药物干预和组成型激活/失活技术，阐明P2Y6受体激活调控成肌细胞迁移的作用和信号转导机制。我们成功构建了P2Y6基因沉默稳定表达成肌细胞株；采用Transwell小室迁移和细胞划痕修复实验，证实阻断或基因沉默P2Y6受体，显著提高了成肌细胞的迁移能力；CCK-8和MTS细胞增殖活性实验显示P2Y6受体并未参与成肌细胞的增殖，其与成肌细胞的中期分化的调控无关。采用基因芯片检测P2Y6受体基因沉默稳转株与野生型细胞株，证实了差异表达最显著的42个基因及其所在的10个经典信号通路，以及与这些信号通路相关的差异表达显著21个迁移相关分子；生物信息学分析提示PLC-IP3和RhoA/ROCK信号通路与P2Y6受体激活密切相关。Western Blot证实基因沉默P2Y6受体可使成肌细胞内RhoA/ROCK表达上调，其下游分子lim及cofilin磷酸化水平升高；钙离子成像也显示成肌细胞内钙离子浓度显著上调。免疫荧光证实基因沉默或阻断P2Y6受体均可显著增加了成肌细胞骨架蛋白β-tubulin和actin的表达水平以及成肌细胞的融合率。上述实验结果提示，阻断或基因沉默P2Y6受体可能使得成肌细胞内钙池无法活化释放钙离子，从而激活信号通路RhoA/ROCK蛋白信号通路，上调其下游信号分子lim及cofilin磷酸化水平，增强细胞骨架相关蛋白表达和骨架重排，促进成肌细胞的迁移能力和细胞融合。