源新疆盐湖嗜盐微生物中降解菊酯类农药资源菌的筛选鉴定与功能研究

For a large number of non-active pyrethroid pesticides into the environment, the ecological and environmental, human health posed a serious threat, so to use extreme environmental microbial remediation of environmental study of pyrethroid pesticides reduce the input of non-active isomers, both to reduce damage to the ecological environment, and increased control. Microbial degradation of ecological environment is clear of pesticide residues in an important way. This research main by CM double solid medium select comes from Xinjiang Salt Lake halophilic bacterium in the degradation Chrysanthemum ester class pesticide of Halophilic bacteria groups, by 16S rRNA full sequence, application 454 measuring sequence method identification, and from GenBanK, data in the get of sequence than on determines system evolution status, for system classification identification of while, research halophilic bacteria selective degradation Chrysanthemum ester class pesticide characteristics and mechanism, clone degradation ester enzyme gene, and expression validation its function, analysis of degradation Gene Prediction of protein activity and correspondence between Chrysanthemum ester pesticides. Research on degradation of pyrethroid pesticides on the one hand this halophile resources system of classification, identification and phylogenetic analysis of, on the other hand genetic engineering methods for the construction of engineering bacteria degrading pesticide to provide the scientific basis, revealed the halophilic bacteria for degradation of pesticides in environmental restoration, for extreme environment application research of microbial genetic resources.

针对大量无活性的菊酯类农药投入到环境中，给生态环境，人类健康带来严重的威胁，因此，利用极端环境微生物修复环境，研究减少菊酯类农药无活性异构体的投入方法，既能减轻对生态环境的危害，又能增加防治效果。微生物降解是生态环境中清除农药残留的一种重要途径。此研究主要通过CM双层固体培养基选择源于新疆盐湖嗜盐菌资源中降解菊酯类农药的嗜盐菌类群，通过16S rRNA全序列，应用454测序法鉴定，并与从GenBank等数据中获得的序列比对确定系统进化地位，进行系统分类鉴定的同时，研究嗜盐菌选择性降解菊酯类农药特性与机理，克隆降解酯酶基因，并表达验证其功能，分析降解酯酶基因预测蛋白的活性与菊酯类农药之间对应关系。本研究一方面对降解菊酯类农药的嗜盐菌资源系统分类鉴定及系统进化分析，另一方面利用基因工程方法为构建高效降解农药的工程菌提供科学依据，揭示嗜盐菌在环境恢复中对农药的降解规律，为应用研究提供研究材料。

降解菊酯类农药毒害是当今十分重要的污染问题，本研究从源新疆盐湖和田地区土壤样品中筛选出高效降解菊酯类农药嗜盐菌，对表性特征、系统发育学分系，降解菊酯类农药特性结果表明：该地区分离纯化中度嗜盐菌57株。其优势类群为厚壁菌门（Firmicutes），最优势属为芽孢杆菌科Halobacillus属，占总菌数49%。其次为变形菌门，最优势属为盐单胞菌属（Halomonas）。57个代表菌株中多数菌株具有功能酶活性，其中57株菌具有过氧化氢酶活性，37株菌株具有氧化酶活性，20株菌能够产淀粉酶，10株菌株产明胶酶，有酯酶活性的菌株有42株，多数菌株具有水解不同底物的酯酶活性。.通过富集培养的方法，分离出43株能够以900mg/L甲氰菊酯、联苯菊酯为唯一碳源生长的中度嗜盐菌。分离筛选出一株嗜盐古菌，与Halobiforma lacisalsi AJ5(T)相似性为95.13%，初步判断为嗜盐古菌新物种。.通过对分离筛选得到的降解菌进行复筛后，筛选出了一株高效降解菌株HDM-39 ,在甲氰菊酯、联苯菊酯的浓度为100mg/L、pH 7.0、37℃、180r/min震荡培养条件下，5d的降解率分别为91.7%，66.7%。经16S rRNA基因序列分析以及表性特征，该菌株为盐单胞菌属（Halomonas ramblicola），相似性为98.81%，菌落颜色为乳白色，随着培养时间的增加菌株颜色逐渐变为粉色，NaCl生长范围为3-30%，最佳浓度5-8%；温度生长范围为4-40℃。.随着高效降解菌HDM-39在培养基中的增长联苯菊酯、甲氰菊酯的残留量不断降低，通过对接种量、pH、初始浓度对菌株 HDM-39降解两种菊酯农药的影响，确定了最佳降解条件。结果显示，该菌接种量为10%、pH7.0-7.5、温度37℃条件下，5d能够将浓度为100 mg/L甲氰菊酯、联苯菊酯完全降解，但随着农药初始浓度的增加降解率逐渐降低。.采用高通量测序手段获得该高效降解菌HDM-39的全基因组序列。对其进行注释和分析，着重寻找与菊酯农药降解有关的基因。菌株Halomonas sp.HDM-39 基因组大小为4,208,766bp，其G+C 含量为67.9%。通过RAST 在线服务器注释得到3800个编码序列其中包含58个tRNAs。在这些基因中，共有 2576（67.8%）个基因被已知功能的基因覆盖。