与水稻GBSS1酶活性相关氨基酸位点的研究及其在稻米食用品质改良上的应用

本项目以水稻蜡质基因编码的GBSS1酶蛋白作为研究对象，综合生物化学、遗传学、生物信息学及结构生物学的方法，分析影响GBSS1直链淀粉合成活性的氨基酸或功能域：1、收集不同直链淀粉含量的水稻品种，分析其GBSS1的氨基酸序列，归纳总结GBSS1氨基酸序列的变化（自然变异）与其酶活及稻米直链淀粉含量的内在联系；2、构建蜡质基因的定点突变质粒，转化无直链淀粉合成的水稻品种，测定转基因水稻中GBSS1酶活与直链淀粉含量，揭示与GBSS1酶活相关的核心氨基酸；3、将蜡质基因的野生型与不同突变的cDNA片段构建在原核表达载体上，表达不同氨基酸序列的GBSS1蛋白，利用 X衍射晶体学和计算机模拟技术，确定它的活性区域和核心氨基酸。综合研究结果，可以鉴定和筛选出与GBSS1酶活相关的关键氨基酸或功能域，构建具有不同直链淀粉合成活性的蜡质基因，为实现稻米直链淀粉合成的精细调控和稻米品质改良工程奠定基础。

水稻Waxy（Wx）基因编码的OsGBSS1负责水稻胚乳中直链淀粉的合成。直链淀粉含量的高低在影响种子的透明度的同时影响着胶稠度和糊化温度，并最终影响蒸煮食用品质。通过本项目研究，第一，我们发现在水稻胚乳中，OsGBSS1可以形成自身寡聚体，聚合化的OsGBSS1酶活被大幅提升。随后，我们对影响OsGBSS1寡聚化的因素进行了初步探究。其次，我们通过生物信息学分析， 将OsGBSS1氨基酸序列进行了基于蛋白结构的定点改造，转基因分析表明，我们所选择的这些氨基酸位点对OsGBSS1酶活具有不同程度的影响。进一步的分析表明，不同的突变使OsGBSS1蛋白与淀粉颗粒、ADPG的结合能力以及蛋白自身的稳定性发生了变化，可能由此导致了酶活性的不同变化。第三，我们收集了不同地区直链淀粉含量不同的45个水稻栽培品种，通过序列测定鉴定获得4个首次发现的造成OsGBSS1单个氨基酸置换的突变位点，在对具有这些突变的自然突变体材料进行OsGBSS1比酶活测定后我们发现，相比无突变材料，其活性水平有不同程度的降低，提示这些位点的氨基酸可能对OsGBSS1酶活有不同程度的贡献。上述研究结果将不仅增加研究者对稻米品质形成的分子机理的认识，同时也将丰富水稻品质改良中可用的技术手段和基因资源。