MRTF-A调控Spag6对缓解缺血性脑卒中再灌注损伤的作用机制

Cerebral ischemic stroke-reperfusion (CIS/R) following hydrocephalus is the principal cause of death and disability in patients with stroke that is no effective treatment. The transcription factor MRTF-A can restrain neuron apoptosis induced by hypoxia/ischemia, however the molecular mechanism remains unclear. The deficiency of sperm-associated antigen 6 (Spag6) leads to defect of structure and function of the motile cilia with hydrocephalus in mice. In the process of CIS/R, the expression of both MRTF-A and Spag6, which are located in the ependymal cells and motile cilia, is consistent with the structure disorder of motile cilia. In silico analysis shows a putative MRTF-A binding site (CarG box) in the Spag6 promoter region. It is suggested that MRTF-A may be an important factor for regulating the structure and function of motile cilia, which alleviates CIS/R-induced hydrocephalus by activating expression of Spag6. Thus, the purpose of this project is to study the role of MRTF-A on transcriptional regulation of Spag6 and its effect on the structure and function of motile cilia on ependymal cells during CIS/R in vitro and in vivo by comprehensive techniques, such as lentivirus infection, TEM, EMSA. This study will provide new theory basis for the prevention and treatment of CIS/R injury.

缺血性脑卒中再灌注（CIS/R）继发脑水肿损伤，是脑卒中患者致死致残主要原因，无有效治疗手段。转录因子MRTF-A可抑制缺氧缺血介导的神经元凋亡缓解CIS/R损伤，但具体机制不明。已知，精子相关抗原6（Spag6）缺失可致运动纤毛功能缺陷引发脑水肿。CIS/R过程中，定位于室管膜细胞和运动纤毛的MRTF-A、Spag6表达水平与运动纤毛结构紊乱程度呈正相关，且Spag6启动子上含MRTF-A结合位点（CarG盒）。提示MRTF-A可能是调节运动纤毛结构功能的重要因子，其可通过调控靶基因Spag6转录表达缓解CIS/R引发的脑水肿。因此，本研究以CIS/R为研究对象，采用慢病毒感染、电镜、EMSA等技术，在整体动物和细胞水平系统研究MRTF-A对Spag6的转录调控作用，及其在CIS/R过程中对室管膜细胞上运动纤毛结构功能的影响。课题的实施可望为CIS/R损伤的防治提供新思路和作用新靶点。

缺血性脑卒中再灌注（CIS/R）继发脑水肿损伤，是脑卒中患者致死致残主要原因，无有效治疗手段。转录因子MRTF-A可抑制缺氧缺血介导的神经元凋亡缓解CIS/R损伤，但具体机制不明。已知，精子相关抗原6（SPAG6）缺失可致运动纤毛功能缺陷引发脑水肿。CIS/R过程中，定位于室管膜细胞和运动纤毛的MRTF-A、SPAG6表达水平与运动纤毛结构紊乱程度呈正相关，提示MRTF-A可能是调节运动纤毛结构功能的重要因子，其可通过调控靶基因SPAG6转录表达缓解CIS/R引发的脑水肿。因此，为确定MRTF-A缓解CIS/R损伤的具体机制，本项目在构建了CIS/R模型的大鼠脑室，通过慢病毒感染技术分别上调或抑制MRTF-A、SPAG6的表达。通过神经功能评分、TTC染色、脑水含量等技术，整体评价MRTF-A的抑制CIS/R的效应；通过HE、高尔基染色、透射电镜、免疫荧光等技术，观察神经元细胞损伤、运动纤毛及突触等超微结构改变、蛋白表达定位；通过western blot、荧光素酶报告基因等技术，确定自噬、突触可塑性等相关蛋白表达，以及运动纤毛相关基因转录活性。结果发现，MRTF-A可有效抑制缺血性脑卒中介导的脑梗死体积，减少神经元细胞损伤，恢复树突棘和突触结构紊乱，其主要分子机制是由于MRTF-A通过抑制mTOR通路调控自噬相关基因Beclin-1、ATG5、LC3的表达诱导了神经细胞自噬的发生，并通过作用突触相关基因CaMKII、CREB、GluR1、PSD95、Synaspin1的表达，进而缓解了缺血性脑卒中介导的突触损伤；而SPAG6高表达可协同MRTF-A调控脑室运动纤毛的活性缓解缺血性脑卒中损伤，一旦SPAG6表达被抑制，MRTF-A的神经保护作用减弱。虽然MRTF-A可上调SPAG6的蛋白表达，但这一作用是间接性而非直接性；除此之外，本研究还发现SPAG6在大脑皮层和海马区的神经元细胞中也存在表达，上调缺血区组织中的SPAG6，通过调控突触相关基因CaMKII、PSD95表达，有效缓解脑缺血再灌注造成的突触、树突棘的损伤，逆转脑水肿现象。综上所述，本研究揭示了MRTF-A激活自噬维系突触可塑性，通过作用SPAG6表达缓解CIS/R介导的室管膜细胞上运动纤毛结构功能损伤。课题的实施可望为CIS/R损伤的防治提供新思路和作用新靶点。