基于内质网应激的清热利湿法防治阻塞性黄疸肝损伤的分子机制研究

Liver injury is a common complication of obstructive jaundice, the cause has not fully understood yet, clinical prevention and control is still a difficult problem still. We found the task group, obstructive jaundice can lead to liver cells apoptosis increased significantly, as a result if we give clearing away heat and draining dampness Chinese traditional medicine which can inhibit the apoptosis. Recently ,studies found that the endoplasmic reticulum stress is the important way to cause cell death. Endoplasmic reticulum stress and induce apoptosis and obstructive jaundice is caused by the liver injury,clearing away heat and draining dampness Chinese medicine is through the endoplasmic reticulum stress signal pathway control the apoptosis, is not yet reported. Through the RT-PCR, the Western blot and siRNA technology, we can study the endoplasmic reticulum stress on the liver cell apoptosis, and the effects of obstructive jaundice mechanism by which can lead to liver cell apoptosis and clearing away heat and draining dampness Chinese traditional medicine intervention mechanism of traditional Chinese medicine. And the in vitro research foundation, establish obstructive jaundice SD rat liver injury model, testing the endoplasmic reticulum stress gene expression, understand the endoplasmic reticulum stress on the obstructive jaundice liver injury cell apoptosis of the specific mechanism and signal ways and clear heat cholagogue intervention mechanism of traditional Chinese medicine, and expect to further clarify the molecule level of obstructive jaundice liver injury mechanism, and the bravery of the traditional Chinese medicine for heat and providing the possible molecular targets, further promoting the modernization of traditional Chinese medicine therapeutic.

肝损伤是阻塞性黄疸常见的并发症，目前病因尚未完全阐明，临床防治仍是难题。我们课题组前期研究发现，阻塞性黄疸可导致肝细胞凋亡显著增加，而给予清热利湿中药可抑制这种凋亡。近年研究发现内质网应激是引起细胞凋亡的重要途径。内质网应激及其诱导的凋亡是否与阻塞性黄疸所致肝损伤有关，清热利湿中药是否通过内质网应激信号通路调控这种凋亡，目前尚未见报道。本研究通过RT-PCR、Western blot 及siRNA 等技术，研究内质网应激对肝细胞凋亡的影响、阻塞性黄疸通过何种机理导致肝细胞凋亡以及清热利湿中药的干预机制。并在体外研究基础上，建立阻塞性黄疸SD大鼠肝损伤模型，检测内质网应激相关基因表达，了解内质网应激对阻塞性黄疸肝损伤细胞凋亡的具体机理和信号途径以及清热利湿中药的干预机制，期望在分子水平进一步阐明阻塞性黄疸肝损伤的机理，并为清热利湿中药的防治提供可能的分子靶点，进一步推动中医治则的现代化研究。

阻塞性性黄疸是外科常见病，肝损伤是阻塞性黄疸常见的并发症，目前病因尚未完全阐明，临床防治仍是难题。我们课题组研究发现，阻塞性黄疸可导致肝细胞凋亡显著增加，而给予清热利湿中药可抑制凋亡。本研究成功建立了阻塞性黄疸大鼠肝损害模型，观察了阻塞性黄疸时Caspase-12、calpain 2、GRP78、PERK等在大鼠肝组织中的表达变化，初步探讨了中药茵陈蒿汤对阻塞性黄疸时肝脏的保护作用及与Caspase-12、calpain 2、GRP78、PERK等表达的关系。同时，通过研究不同血清干预大鼠正常肝细胞中后IRE1α的表达变化，探讨了阻塞性黄疸肝损伤的发生机制及中药茵陈蒿汤对肝细胞的保护机制。Caspase-12在阻塞性黄疸大鼠肝损害中可以诱导ERS发生，阻塞性黄疸早期肝细胞启动程序性死亡，Caspase-12的高表达可以通过内质网途径促进细胞凋亡。ERS发生后由于蛋白合成受阻，使Caspase-12转录及翻译减少，同时也有部分处于凋亡进程中的肝细胞被Kupffer吞噬。阻塞性黄疸大鼠给予中药茵陈蒿汤可以抑制Caspase-12 mRNA和蛋白的表达，减少因Caspase-12高表达导致的ERS，从而减少肝损伤，改善肝脏因梗阻引起的肝功能异常。同时，随着造模时间的延长，calpain 2蛋白及m-calpain基因表达水平呈逐渐增加趋势，GRP78蛋白及GRP78mRNA表达下降，PERK蛋白及PERK mRNA表达水平呈逐渐增加趋势，表明在OJ大鼠模型中，存在ERS，且凋亡指数逐渐增加。 OJ大鼠给予中药茵陈蒿汤可以抑制calpain 2蛋白水平及基因水平的表达，减少因calpain 2蛋白高表达引起的肝细胞损伤，可以使GRP78mRNA的表达上调，可以调节PERK mRNA的表达，进而减少因PERK高度表达引起的肝细胞损伤，改善肝脏因梗阻引起的肝功能异常。在细胞实验中，成功建立阻塞性黄疸大鼠肝细胞损伤模型，由IRE1α-JNK介导ERS途径的肝细胞凋亡，是阻塞性黄疸引起肝损伤的可能机制。中药的作用可能是通过抑制IRE1α蛋白的过度激活，从而降低ERS反应，进而改善肝细胞因阻塞性黄疸血清而引起的肝功能异常。本研究在分子水平进一步阐明阻塞性黄疸肝损伤的机理，并为清热利湿中药的防治提供可能的分子靶点，进一步推动中医治则的现代化研究。