动物内源性多肽CGA-N46抗真菌作用机制研究

针对病原真菌耐药性问题，寻找新型抗真菌物质、研究其作用机制对开发疗效更高的新药具有重要科学意义。嗜铬粒蛋白A (Chromogranin A)N端衍生多肽CGA-N46是一种动物内源性多肽，具有抗真菌功能。该项目采用NCCLS推荐的微量稀释法研究CGA-N46抗菌谱，筛选敏感菌。采用同位素掺入法研究CGA-N46对细胞壁合成的影响，采用Langmuir-Blodgett技术和膜片钳技术研究CGA-N46对敏感菌细胞膜的作用，采用激光共聚焦显微镜研究CGA-N46对敏感菌线粒体呼吸作用的影响；采用紫外吸收光谱法和荧光光谱法研究CGA-N46对染色体结构的影响，采用同位素掺入法研究CGA-N46对敏感菌DNA、RNA和蛋白质合成的影响；建立真菌感染动物模型，通过组织切片，观察动物组织生理指标体系的变化。从细胞、分子水平和动物整体水平阐明CGA-N46作用机制，为开发新型抗真菌药物奠定理论基础。

本研究采用微量稀释法、透射电镜、Langmuir-Blodgett、激光共聚焦、流式细胞仪、荧光显微镜、分子生物学技术及克柔念珠菌感染小鼠模型，研究CGA-N46细胞、分子及动物整体水平的抗真菌作用机制。研究首次发现：（1）在14种临床病原真菌中，克柔念珠菌是CGA-NA46的敏感菌；（2）CGA-N46与克柔念珠菌孵育3h后，细胞壁和细胞膜之间腔隙变暗，细胞膜完整，线粒体膜界限模糊，核膜出现腔隙；CGA-N46不影响克柔念珠菌细胞壁的合成，对克柔念珠菌细胞膜通透性没有影响；（3）CGA-N46降低克柔念珠菌线粒体ROS水平，降低线粒体膜电位；使克柔念珠菌分子量为80KD、43KD和10KD的线粒体蛋白表达上调；（4）CGA-N46不与染色体DNA结合， 对DNA结构没影响；将克柔念珠菌细胞分裂阻滞在S期，说明CGA-N46阻滞DNA合成；（5）CGA-N46稳定性好，80℃加热30min、室温存放24h、6次反复冻融、外环境pH 变化在4.0~7.0范围内，对CGA-N46抗菌活性影响不明显；与氟康唑、特比萘芬联合用药，表现出相加作用；CGA-N46对红细胞没有溶血性，对正常成纤维细胞生长没影响，对肺癌细胞生长有抑制作用；（6）CGA-N46能够消除克柔念珠菌感染小鼠炎症反应。上述研究结果表明，CGA-N46主要通过作用于线粒体和阻滞DNA合成发挥抗真菌作用，是一种新型抗真菌作用机制。该结果为CGA-N46作用靶点研究提供了新思路。