铅引发PI3K/Akt通路激活在血－视网膜屏障损伤中的作用与机制研究

In recent years, enviromental Pb content tends to increase gradually, leading to greater exposure in humans, especially children.Pb is an environmental pollutant with strong neuron toxicity. Lont-term exposure of Pb causes a dysregulation of the central nerve system. Our recent studies showed that exposure of rats in growth and development phase to Pb increases the permeability of their Blood-Retinal Barrier (BRB), that consequently affects the BRB structure and function. However, it remains largely unknow how Pb exposure affects the BRB. On the basis of our preliminary studies, we plan to use cellular, immunohistochemistry and Molecular Biology techniques to study: (1)the effect of various doses of Pb on the BRB permeability of rats in growth and development phase; (2)the molecular mechnisms of Pb-induced increase of the BRB permeability by focusing on PI3K/Akt-induced phosphorylation of tight-junction proteins and their assembly on cell surface after Pb exposure; (3)the potential protection of PI3K/Akt inhibitors on Pb exposure-caused BRB damage. This study will reveal some of the molecular mechnisms by which Pb exposure induces the BRB opening, thereby provides some novel approaches for prevention of Pb-induced injury.

近年来,环境中铅含量有逐年增高的趋势,提高了人群尤其是儿童的铅接触水平。铅具有很强的神经毒性，长期接触可导致中枢神经系统的改变。我们新近研究发现铅暴露可使生长发育期大鼠血视网膜屏障（Blood-Retinal Barrier,BRB）通透性发生改变，进而对视网膜结构和功能产生一定的影响，但其确切机制尚不清楚。本课题拟在前期实验研究的基础上，应用细胞生物学、免疫组织化学和分子生物学等方法进一步研究：（1）不同铅水平对生长发育期大鼠BRB通透性的影响；（2）从PI3K/AKt调节紧密连接蛋白磷酸化修饰及其在细胞膜上的聚集角度探讨铅对生长期大鼠BRB通透性的机制；（3）PI3K/AKt通路抑制剂对铅引发的BRB损伤的保护作用及其可能性机制。研究结果将在分子水平上进一步阐明铅诱导BRB开放的分子机制，为铅损伤的防治提供新的思路和实验依据。

铅具有很强的神经毒性，预防儿童铅中毒一直是各国政府面临的主要环境健康问题之一。作为中枢神经系统重要分支的视觉系统，视网膜也是铅毒性损伤的敏感靶器官。在动物实验及人类研究中，在发育中或成年性低到中等剂量的铅暴露，能够导致视网膜功能紊乱或退变；但是在体内，尽管高剂量的铅能够破坏血脑屏障中的紧密连接并增加其通透性，但高剂量铅暴露对血视网膜屏障的作用尚未被研究。本课题通过构建环境相关性剂量依赖性的短期铅暴露大鼠模型；评价血视网膜外屏障的组织学及功能学的完整性；研究对血视网膜外屏障通透性起到关键作用的跨膜蛋白occludin及claudin-5的表达；检测PI3k-Akt信号通路在血视网膜外屏障通透性增加中所发挥的潜在作用，阐明铅毒性引起的血视网膜屏障通透性改变的调控机制。结果发现：构建环境相关性剂量依赖性的短期铅暴露大鼠模型，分为饮用自来水，0.01%铅溶液、0.02%铅溶液共三组，共计6周，三组大鼠6周后血铅的平均水平分别为1，12.5，19 μg/dl；运用组织学、体视学、免疫印迹密度计量学、药学及定量分析的技术研究显示铅暴露导致剂量依赖性的1）视网膜外核层及内核层厚度下降，2）视网膜通透性增加，3）occludin和claudin-5蛋白表达的下调，4）增加pAKt (Ser473)的表达，而非pAkt(Thr308)；5）wortmannin能部分或完全阻断血视网膜外屏障通透性的增加和紧密连接蛋白表达的减少。以上研究结果表明，铅暴露引起PI3K-Akt信号通路部分参与血视网膜外屏障通透性的增加，提示环境和职业性的铅暴露是老年性黄斑变性、糖尿病、中风等疾病中，血视网膜外屏障通透性增加的危险因素。研究结果在分子水平上进一步阐明铅诱导BRB开放的分子机制，为铅损伤的防治提供新的思路和重要实验依据。