玉米β-胡萝卜素羟化酶2基因种子特异性表达的调控机制

Carotenoids play a critical role in human nutrition and health. It has been demonstrated that carotenoid biosynthesis and accumulation in maize (Zea mays) endosperm are primarily controlled by some key (but not all) carotenogenic gene (e.g. phytoene synthase 1 gene, and non-heme di-iron β-carotene hydroxylase 2 gene) expression. However comparatively little is known about expression regulation of carotenogenic genes which control carotenogenesis in maize endosperm. In this project, the transgenic rice plants will be used to further characterize maize β-carotene hydroxylase 2 (ZmBCH2) gene promoter and transcription factors which specifically recognize and bind to the cis-acting elements of ZmBCH2 gene promoter that controls seed-specific ZmBCH2 gene expression in maize. The overexpression or suppression of one transcription factor gene or two transcription factor genes in transgenic maize plants will be used to analyze simultaneously for endogenous ZmBCH2 gene and other carotenogenic gene expression, as well as carotenoid profiles in different organs and endosperm at different seed developmental stages in order to observe the regulatory mechanisms of ZmBCH2 gene expression controlled by transcription factors. We will carry out Yeast-Two-Hybrid (Y2H) system, GST Pull-Down and Biomolecular Fluorescence Complementation (BiFC) assays to identify the interaction between the isolated transcription factors involved in the regulation of seed-specific gene expression. The anticipated outcomes of proposed project will provide insights into the molecular control mechanisms of ZmBCH2 gene expression and carotenoid accumulation in maize endosperm during seed development. The isolated and characterized seed-specific ZmBCH2 gene promoter and transcription factor genes will be very useful molecular tools for the metabolic engineering of carotenoid accumulation in maize endosperm.

类胡萝卜素对人类营养和健康具有重要价值。研究表明玉米种子胚乳类胡萝卜素合成和积累主要是由一些关键类胡萝卜素合成基因（如，玉米八氢番茄红素合酶1和β-胡萝卜素羟化酶2基因）表达调控的。但到目前为止，对玉米种子类胡萝卜素合成基因表达调控机制知之甚少。本项目拟在转基因水稻中对玉米种子特异性表达β-胡萝卜素羟化酶2(BCH2)基因启动子以及与其顺式作用元件特异结合的转录因子进行功能分析和鉴定；在玉米中鉴定超表达或抑制一个或二个转录因子对胚乳等器官内玉米BCH2基因和其它类胡萝卜素合成基因表达以及类胡萝卜素组分和含量的影响；用酵母双杂交、GST Pull-Down和双分子荧光互补技术鉴定克隆的转录因子间的相互作用；揭示克隆和鉴定的转录因子在玉米种子发育过程中对玉米BCH2基因表达和类胡萝卜素组分和含量积累的调控机制，为利用基因工程技术在玉米种子胚乳中生产类胡萝卜素的分子育种提供新的基因源和奠定基础。

类胡萝卜素对人类营养和健康具有重要价值。玉米是非洲许多地区的主食，但胚乳通常含有低水平的维生素A类胡萝卜素β-胡萝卜素，导致依赖谷类食物的人群中维生素A缺乏症。我们应用RNA干扰（RNAi）技术抑制玉米胚乳中的内源β-胡萝卜素羟化酶2(ZmBCH2)基因表达。无论ZmBCH1基因是否同时被抑制，在ZmBCH2基因沉默的所有玉米杂交种胚乳中的β-胡萝卜素含量都显著增加。ZmBCH2基因具有玉米胚乳优先和种子发育调节的表达特性，但详细的调节机制尚不清楚。为了深入了解ZmBCH2基因表达的调节机制，我们分离了ZmBCH2基因的5'-侧翼区（2036 bp），其中有包含第一个内含子的263-bp 5'-非翻译区（5'-UTR）。 我们将其与β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）报告基因gusA相连构建融合基因表达载体。我们发现水稻种子中gusA的高水平表达需要5'-UTR区域。只要启动子近端存在醇溶蛋白盒和AACA基序，ZmBCH2基因启动子的截短变体基本启动子即可保留其种子优先的表达模式。我们鉴定到克隆的玉米ZmPBF和ZmGAMYB转录因子基因在玉米叶片和种子胚乳及胚中的时空表达模式与ZmBCH2基因表达模式相似。过量表达ZmPBF和ZmGAMYB转录因子都可以反式激活玉米胚乳中的ZmBCH2基因表达。为了消除玉米实验系统中潜在的混杂效应，我们在转基因水稻中共表达ZmBCH2基因基础启动子驱动的报告基因gusA和ZmPBF基因和/或ZmGAMYB基因的研究表明，ZmPBF和ZmGAMYB转录因子可独立地反式激活ZmBCH2基因启动子。该课题获得的研究成果为应用基因组编辑技术直接突变玉米內源ZmBCH2基因启动子关键顺式作用元件或者敲除玉米內源ZmPBF和ZmGAMYB转录因子基因提高玉米种子胚乳中β-胡萝卜素的积累奠定了基础。因此，本课题获得的成果对玉米种子胚乳中类胡萝卜素合成和积累调控的分子生物学研究具有重大的理论意义和广阔的应用前景。