玉米细胞色素P450胡萝卜素羟化酶基因的克隆及其鉴定

类胡萝卜素对人类营养和健康具有重要价值。在应用遗传工程技术提高植物靶器官中某一特定类胡萝卜素含量时，存在很大的盲目性，这主要是由于目前人们对植物体内类胡萝卜素积累的调控机制等还不甚清楚。本项目从玉米种子胚乳中克隆细胞色素P450(CYP)胡萝卜素β-环羟化酶和胡萝卜素ε-环羟化酶cDNA；用可积累各种酶的反应底物的工程大肠杆菌系统鉴定克隆的全长cDNA编码的酶的功能；通过在玉米种子胚乳中超量表达CYP胡萝卜素β-环羟化酶基因，研究其在种子胚乳中的超表达对胚乳中玉米黄质等类胡萝卜素组分和含量的影响；通过在玉米种子胚乳中超量共表达CYP胡萝卜素β-环羟化酶和β-胡萝卜素酮酶基因，研究其在玉米种子胚乳中的超表达对胚乳中虾青素合成效率的影响；揭示他们对玉米种子胚乳类胡萝卜素合成和积累的调控机制，为利用基因工程技术培育具有较高含量的玉米黄质和/或虾青素的玉米新种质提供新的基因源和奠定基础。

类胡萝卜素对人类营养和健康具有重要价值。在应用遗传工程技术提高植物靶器官中某一特定类胡萝卜素含量时，存在很大的盲目性，这主要是由于目前人们对植物体内类胡萝卜素积累的调控机制等还不甚清楚。为了进一步深入了解部分鉴定的玉米类胡萝卜素生物合成途径，我们从玉米（Zea myas L.）自交系B73种子胚乳中克隆了细胞色素P450(CYP)胡萝卜素β-环羟化酶（ZmCYP97A和ZmCYP97B）和胡萝卜素ε-环羟化酶（ZmCYP97C）cDNA。所有编码胡萝卜素β-环羟化酶和ε-环羟化酶的玉米CYP97基因在玉米基因组中都是单拷贝的。ZmCYP97A、ZmCYP97B和ZmCYP97C基因分别位于玉米第5、第4和第1染色体上，每个基因的编码框序列分别含有14、13和9个内含子。这三个基因都是在玉米授粉后第10天的胚乳中表达较高，而后逐渐下降，直到授粉后第25天的胚乳中表达最低。在拟南芥基因敲除的突变体，lut1（敲除cyp97c1突变体的表型）、lut5（敲除cyp97a3突变体的表型）和lut1lut5（敲除cyp97c1 cyp97a3双突变体的表型）中分别过表达在CaMV 35S启动子驱动下的ZmCYP97A、ZmCYP97B和ZmCYP97C基因。通过对以上转化的拟南芥纯系基生叶的类胡萝卜素组分和含量以及转基因表达分析等，我们鉴定了玉米细胞色素P450类胡萝卜素羟化酶基因编码的酶的功能。ZmCYP97A和ZmCYP97C基因编码的酶蛋白分别具有胡萝卜素β-环羟化酶和胡萝卜素ε-环羟化酶的活性，重要的是，我们首次证明ZmCYP97B基因编码的酶蛋白不仅具有胡萝卜素β-环羟化酶的活性，而且还具有微弱的胡萝卜素ε-环羟化酶的活性。研究表明，玉米非血红素β-胡萝卜素羟化酶2（ZmBCH2）是玉米种子胚乳中β，β-胡萝卜素生物合成的关键酶。ZmBCH2基因在玉米种子中特异性表达。我们证明了ZmBCH2基因起始密码子上游774 bp启动子中含有所有必要的顺式调控元件来驱动GUS报告基因在转基因水稻种子中特异性表达。我们也发现龙胆玉米黄质环氧化酶基因的表达与有色体的分化和发育密切相关，表明在玉米黄质环氧化酶基因与存储类胡萝卜素的有色体发育之间有进化保守的连接。我们应用克隆的玉米种子胚乳特异性表达启动子和多基因转化等技术，开展了改良玉米淀粉质量和数量及其他农艺性状的基因工程。