从肠源性内毒素血症诱导肝星状细胞NF-κB的活化探讨大黄蜇虫丸抗肝纤维化机制

The activation of Hepatic stellate cells (HSC) is the center process of liver fibrogenesis. Intestinal endotoxin whose major content is lipopolysaccharide (LPS), can activate NF-κB of HSC through Toll-like receptor 4 (TLR4), promote nuclear transcription factor NF-κB activation, leading to the decrease of BMP and the activin membrane-bound inhibitor (BAMBI), that is a pseudo-receptor of transforming growth factor-β(TGF-β). Dahuangzhechongwan (DHZCW), that is a traditional Chinese medicine, has been used to therapy liver fibrosis in clinic patients, but the mechanism was not been elucidated clearly. This process must increase the sensitivity of HSC to TGF-βand further more, promote fibrogenesis. This project will study the molecular mechanism of DHZCW anti-fibrosis by pathways of LPS-TLR4-NF-κB-BAMBI. By way of immunohistochemistry stain, Westernblot, RNAi and adenovirus infection and confocal microscopy, the change of each upper-stream molecular of BAMBI will be observe in liver fibrosis rats, primary HSC cells and HSC-T6 cell line after DHZCW treatment. This project is to illuminate the molecular mechanism of DHZCW treating liver fibrosis and will be benefit for exploiting traditional Chinese medicine.

肝星状细胞（HSC）的活化是肝纤维化发生发展的中心环节。肠源性内毒素血症的主要成分脂多糖（LPS），通过Toll-like受体4（TLR4）活化HSC核转录因子NF-κB，进而使转化生长因子（TGF）-β的假受体骨成形蛋白-激活素膜结合阻断因子（BAMBI）表达降低，增加了HSC对TGF-β的敏感性，从而产生肝纤维化。大黄蛰虫丸临床广泛用于肝纤维化的治疗，但其机制仍不十分明确。本项目拟从大黄蛰虫丸抑制HSC细胞LPS-TLR4-NF-κB-BAMBI通路角度探讨大黄蛰虫丸抗纤维化的分子机制。项目拟在纤维化大鼠、大鼠原代HSC和HSC-T6细胞系上，用Westernblot、免疫组化、腺病毒感染、RNA干扰、激光共聚焦显微镜、电镜检测等方法，检测大黄蛰虫丸对这条通路相关分子表达的变化，从分子水平认识大黄蛰虫丸治疗肝纤维化的有效靶点和分子机理，为传统中医药进一步的开发奠定理论基础。

肝纤维化是各种原因引起的慢性肝损伤所共有的病理改变。我国是乙肝大国；前瞻性研究表明，慢性乙型肝炎发展为肝硬化的估计年发生率为2.1％；乙肝e抗原阴性慢性乙型肝炎患者进展为肝硬化的发生率为23％。因此，肝纤维化的群体十分巨大。现有研究表明脂多糖（LPS）通过肝星状细胞TLR4—MyD88—NF-κB信号下调TGF-β1假受体BAMBI，放大了TGF-β1信号，促进了肝纤维化。我们假说大黄蛰虫丸可能阻断该途径而治疗肝纤维化。基于该假说，我们用四氯化碳肝纤维化动物模型，大鼠原代HSC以及大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞系，研究大黄蛰虫丸对LPS—NF-κB—BAMBI通路的调节，明确大黄蛰虫丸是否可阻断LPS对TLR4的活化，以及是否阻断NF-κB核转录和BAMBI的表达，从而探讨大黄蛰虫丸抑制肝纤维化的分子机制。.用四氯化碳花生油混合液注射大鼠，建立肝纤维化动物模型。在肝纤维化大鼠中发现，大黄蛰虫丸可以减轻肝纤维化程度，改善肝功能，减少血清LPS，并抑制肝组织中和HSC细胞中TLR4、MyD88表达，以及降低NF-κB的活化，促进BAMBI表达。在细胞实验中发现，大黄蛰虫丸含药血清可抑制LPS诱导的原代HSC和肝星状细胞系HSC-T6细胞TLR4、MyD88的表达和NF-κB的活化，进而促进BAMBI的表达；逆转BAMBI干扰RNA处理后BAMBI的下调；也抑制LPS与其细胞表面配体TLR4的结合，从而抑制NF-κB活化；另外也发现，大黄蛰虫丸含药血清可直接抑制原代HSC和肝星状细胞系HSC-T6细胞系TLR4、MyD88和NF-κB的活化，进而上调BAMBI的表达。.该研究从LPS诱导的HSC活化，促进TGF-β1假受体BAMBI表达而抑制肝纤维化的角度，阐明了大黄蛰虫丸抑制肝纤维化的可能的新的分子机制，为这种传统中成药抗肝纤维化的广泛使用奠定了理论基础。