基于脂联素的多聚化修饰探讨祛湿活血方治疗非酒精性脂肪肝的分子机制

Adiponectin is the only beneficial cytokine for non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).High molecular weight (HMW) adiponectin is major activity form in vivo. Multimerization modification of adiponectin is regulated by molecular chaperones DsbA-L. Our early study has found Queshihuoxue (QSHX) decoction promoted significantly HMW adiponectin expression of serum and adipocyte, and promoted DsbA-L expression of adipocyte. Other studies found that DsbA-L expression is regulated by AMPK and Akt/FOXO1 pathways intra-adipocyte, and extra-adipocyte by TNF-α. This project will study molecular mechanism of regulating high molecular weight adiponectin by QSHX decoction basing on DsbA-L expression of intra- and extra-adipocyte. By way of immunohistochemistry stain, Westernblot, RNAi and adenovirus infection, the change of each upper-stream molecular of DsbA-L after QSHX decoction treatment in NAFLD rats fatty tissue, and the effect of QSHX decoction on DsbA-L/adiponectin expression after blocked or activated above pathway in primary adipocytes and 3T3-L1 line, will be observated. This project is to illuminate the molecular mechanism of QSHX decoction regulating HMW adiponectin and to establish study basis of mechanism for traditional decoction treating NAFLD.

脂联素是目前发现的唯一有益于非酒精性脂肪肝（NAFLD）的细胞因子，高分子量（HMW）脂联素是其主要活性形式，其多聚化修饰主要受分子伴侣DsbA-L调节。我们的工作和已有的研究发现，祛湿活血方能促进脂肪细胞HMW脂联素以及脂肪细胞DsbA-L的表达；脂肪细胞内DsbA-L的表达受AMPK和Akt/FOXO1通路调节，脂肪细胞外，受TNF-α调节。本项目拟从以上调控DsbA-L途径的角度，探讨祛湿活血方在细胞内外对脂联素多聚化的调节机制。项目通过免疫组化、Westernblot、RNA干扰、腺病毒感染等手段，在NAFLD大鼠中观察中药处理后脂肪组织以上通路各分子的变化；以及在原代脂肪细胞和3T3-L1脂肪细胞系，阻断或活化以上各信号通路，观察祛湿活血方对DsbA-L/HMW脂联素表达的影响，以期阐明祛湿活血方调节脂联素多聚化表达的分子机制，可能对中医药靶向治疗NAFLD产生重要影响。

脂联素（APN）是目前被证实唯一的非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)保护性细胞因子，其由脂肪细胞合成分泌，主要抑制肝脏脂肪合成，促进脂肪分解，高分子量的多聚化形式(HMW)在体内起主要的活性作用。其多聚化主要受关键的分子伴侣二硫键A氧化还原酶样蛋白（disulfide-bond A oxidoreductase-like protein，DsbA-L）的调节；而DsbA-L在脂肪细胞外主要受肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的调节，在脂肪细胞内，受AMPK 和Akt/FOXO1两条信号通路调节。先前的临床研究发现中药祛湿活血方(QSHXF)可明显降低NAFLD患者血清甘油三酯水平,减轻NAFLD患者肝脏脂肪沉积程度，因此假说QSHXF治疗脂肪肝可能通过在脂肪细胞外阻断TNF-α介导的DsbA-L/HMW APN的抑制，在细胞内通过调节AMPK 和Akt/FOXO1进而调节DsbA-L/HMW APN的表达而实现。.课题主要研究QSHXF对NAFLD大鼠血清APN和脂肪组织表达HMW APN及相关信号分子的调节作用；TNF-α对NAFLD大鼠原代脂肪细胞和3T3-L1脂肪细胞系APN的调控和QSHXF的抑制作用，以及QSHXF调控APN多聚化信号通路的分子机制。从整体动物水平，用高脂高糖饮食造模，以模型组为对照，观察QSHXF对大鼠血清APN和TNF-α的影响，用Westernblot等方法检测脂肪组织中DsbA-L、HMW APN以及影响APN多聚化通路信号分子AMPK、P-AMPK、Akt、P-Akt、FOXO1、P-FOXO1的变化；在脂肪细胞模型上，检测QSHXF是否能阻断TNF-α对DsbA-L和HMW APN的抑制; 以及在细胞模型上活化Akt/FOXO1或阻断AMPK信号后，用QSHXF干预，检测干预后HMW APN、DsbA-L、AMPK、P-AMPK、Akt、P-Akt、FOXO1、P-FOXO1的变化。.结果发现，在NAFLD大鼠模型上，QSHXF明显减轻了肝脏脂肪细胞变性，降低了ALT, AST, TG, TNF-α,而升高了血清APN，在大鼠脂肪组织中，QSHXF提高了DsbA-L和HMW APN的表达，抑制了Akt/FOXO1的活化， 促进了AMPK的活化；在3T3-L1和原代脂肪