多功能化芳香季铵衍生试剂设计、合成及在肽段衍生物高灵敏度质谱鉴定中的应用研究

Shotgun-based strategy is the most widely used method in proteome research. However, due to the high complexity and the extremely wide dynamic range of proteome samples, the detection of peptides of low-abundance or low-ionization efficiency by mass spectrometry is still challenging. In this project, with the combination of theoretical and computational chemistry, novel aromatic quaternary ammonium derivatization reagents, simultaneous possession of strong hydrophobicity, high gas-phase basicity and a permanent positive charge, will be synthesized, functionalized and further used for peptide labeling via the amino, thiol and carboxyl groups. By combining with the integrated platform for protein separation and identification, we can further develop a novel proteomics technique for site-selective derivatization, high efficient separation and high sensitive detection. This project is of great potential to overcome the shortcomings of mass spectrometry-based proteomic strategy and evidently improve the separation and identification of proteins.

鸟枪法是目前在蛋白质组分离鉴定中应用最广泛的策略。然而，蛋白质组样品的高复杂性、宽动态范围分布使得低丰度肽段以及难于离子化肽段的质谱检测仍旧面临着巨大的挑战。本项目拟在结合理论化学辅助设计的基础上，利用芳香氮杂环化合物的季铵化反应，合成同时具有强疏水性、高气相碱性且包含永久正电荷的新型芳香季铵衍生试剂，并基于多功能化修饰，实现对肽段中氨基、羧基或巯基的衍生；进而通过提高衍生肽段的离子化效率提高其质谱检测灵敏度。进一步结合集成化蛋白质分离鉴定平台，建立肽段选择性衍生、高效分离、高灵敏检测的蛋白质组分离检测新技术。该项目的研究成果有望弥补目前基于质谱的蛋白质组鉴定策略的不足，显著提高蛋白质组的分离鉴定能力。

鸟枪法是蛋白质组分离鉴定中应用最广泛的策略。然而，蛋白质组样品的高复杂性、宽动态范围分布使得低丰度肽和难离子化肽段的质谱检测仍旧面临着巨大的挑战。根据课题任务书的要求，发展了多种新型芳香季铵衍生化试剂，实现了多肽中羧基和巯基的高选择性衍生和高灵敏度质谱鉴定；发展了新型咪唑嵌和C8高效色谱分离材料，实现了多肽的高效分离。完成了课题任务书的要求。.（1）通过结合理论化学计算辅助设计，筛选并合成了6种同时具有强疏水性、高气相碱性且包含永久正电荷的新型咪唑类或吡唑类衍生化试剂，包括溴化1-[3-[(2-碘-1-氧乙基)氨基]丙基]-3-甲基咪唑（IPMI）、溴化1-[3-[(2-碘-1-氧乙基)氨基]丙基]-3-丁基咪唑（IPBI）、溴化1-[3-[(2-碘-1-氧乙基)氨基]丙基]-3-己基咪唑（IPHI）、溴化1-[3-[(2-碘-1-氧乙基)氨基]丙基]-4-甲基吡啶（IMP）、溴化1-[3-[(2-碘-1-氧乙基)氨基]丙基]-4-丙基吡啶（IPP）和溴化1-丁基,3-(3-氨丙基)咪唑（BAPI），通过优化合成方法和纯化条件，实现了衍生试剂的高效合成和纯化。（2）所发展衍生试剂可用于多肽中羧基或巯基的选择性衍生，通过优化标记条件，模式肽段的标记效率均超过98%，实现了肽段的专一高效标记。（3）衍生化肽段的电喷雾质谱和基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱离子化效率可提高1-3个数量级，实现了多肽的高灵敏度质谱鉴定。例如，肽段MECFG经IPP衍生后其电喷雾质谱离子化效率与碘乙酰胺衍生化相比可提高369.7倍。此外，衍生肽段的质谱带电荷数也得到显著提高，以IPMI为例，模式肽段LEACTFRRP和MECFG的质谱带电荷数可分别从2.04和1.00提高至3.31和1.77，增加了62%和77%，有利于实现高效的电子转移裂解质谱分析。（4）考察了所发展衍生试剂对复杂样品的适用性，实现了增强的多肽质谱鉴定。例如，通过结合IMP或IPP衍生，转铁蛋白半胱氨酸肽段鉴定效率可提高42%，实现了互补的蛋白质鉴定。（5）采用一锅法制备了咪唑嵌和C8高效色谱分离材料，其柱效可达124,000 N/m，并实现了牛血清白蛋白酶切产物的高效分离分析。（6）通过本项目支持，共发表SCI论文6篇，申请发明专利2项并授权1项，在高水平会议上发表论文2篇，培养硕士研究生3人.