口蹄疫病毒RGD基序诱导细胞凋亡的分子机制

The VP1 protein of foot-and-mouth disease virus (FMDV) is a multifunctional protein, It not only contains major potential antigenicity domains of FMDV, and a key virus-cell interaction element (RGD motif). Based on the previous research, FMDV binds to cellular integrins through an RGD motif in its capsid protein, and RGD and the integrin all show the activity to induce apoptosis.But details on how to start apoptosis after RGD binding to the cells,the key interaction domains of adaptor protein and signal transduction mechanism were unknown. In this study,First, the RGD-mediated apoptosis and the subcellular localization will be analyzed using flow cytometry and laser confocal methods.Second,The alanine mutation scanning strategy and reverse genetics systems will be used to evaluate the apoptosis differences induced by RGD motif or RGD-mutant motif of GH loop, or the rescued viruses with wild-type RGD motif or RGD mutant motif, and the pathological changes induced by the rescued viruses will also be compared. Then, the RNA interference assay,Co-immunoprecipitation assay and Molecular simulation will be performed to explore the key function domains and amino acids in protein interaction. Finally, Identified the exact signal pathways to control the apoptosis of cell by detecting signaling molecules. This study reveals the molecular mechanism of cellular apoptosis induced by RGD motif, which will pave ways for clarification of FMDV pathogenesis.

口蹄疫病毒（FMDV）结构蛋白VP1是个多功能蛋白，不仅含有主要抗原位点，还含有整联蛋白受体识别位点RGD基序，本项目前期研究发现RGD具有诱导细胞凋亡的功能,而与之结合的整联蛋白也在细胞凋亡中起重要作用。但关于FMDV的RGD基序启动细胞凋亡的关键接头分子及信号转导机制仍不清楚。本研究首先采用流式细胞术与激光共聚焦确定FMDV RGD基序诱导凋亡的调控水平及亚细胞定位；丙氨酸扫描突变和反向遗传技术比较研究RGD突变基序与重组毒株诱导宿主细胞凋亡能力差异及病毒致病性变化；其次用RNAi、免疫共沉淀、分子模拟等方法确定RGD基序与整联蛋白及其互作在细胞调亡中的作用，明确RGD基序与整联蛋白发生互作接头的关键结构域与氨基酸位点；最后通过检测细胞凋亡途径中重要节点分子确认凋亡信号转导路径，从而揭示FMDV的RGD基序参与诱导细胞凋亡的分子机制，为FMDV致病机理研究奠定基础。

前期研究显示口蹄疫病毒颗粒表面VP1蛋白G-H环含有高度保守的RGD基序（精氨酸-甘氨酸-天门冬氨），该基序是病毒粒子与细胞表面整联蛋白结合引起感染的主要结合位点。RGD可通过触发构象改变诱导细胞凋亡，而整联蛋白除参与病毒结合，也在细胞凋亡中起重要作用。因此本研究目的首先确认口蹄疫RGD基序是否通过与整联蛋白相互作用诱导细胞凋亡及其信号传导机制；其次分析RGD突变引发整联蛋白受体识别及病毒致病性变化；最后探究蛋白互作的分子对接位点与空间构象。研究采用流式细胞术、激光共聚焦、反向遗传技术和分子模拟等一系列方法证实FMDV VP1-RGD诱导的细胞凋亡依赖于整联蛋白，且通过线粒体途径诱导凋亡，144位G突变使凋亡程度显著降低；RGD突变重组毒株诱发的致病力在鼠源细胞及乳鼠上增强；但是在猪、牛源细胞和豚鼠上致病性和复制能力显著降低；RGD基序与整联蛋白αvβ6胞外域的结合主要集中在αv亚基，RGD基序的R与α v亚基第217和218位天冬氨酸形成较强的电荷吸引作用力，RGD的D与αv亚基第247精氨酸和第214位丙氨酸形成氢键。在项目的实施中，成功构建FMDV敏感的牛甲状腺传代细胞系，解决口蹄疫研究缺乏牛源传代细胞的困境，完善了口蹄疫不同种属细胞凋亡研究的工作模型。同时研究全面揭示 RGD与整联蛋白相互作用诱导的细胞凋亡分子机制，初步解析了整联蛋白αvβ6胞外域与RGD结合的关键结构域，通过揭示细胞调亡对病毒复制和毒力的影响，为FMDV致病机理研究奠定基础。