Siva蛋白在口蹄疫病毒VP2基因诱导细胞凋亡中的作用研究

Foot-and-mouth disease (FMD) is a highly contagious and economically devastating disease of cattle, swine and other cloven-hoofed ruminants. It is difficult to control because of variability and several serotypes and persistent infection. The study will be developmented on the base of the VP2 inducing host cell apoptosis of FMDV and binding to apoptosis protein siva. Siva will be up-regulation and down-regulation via overexpression or RNA interference technique, and the role of siva in the VP2 inducing apoptosis will be determined. Mutation at different sites of the VP2 , will be made pull-down and other technique can be used for precisely evaluating the sites of the VP2 which induced apoptosis; and then affection of apoptosis will be analyzed when functional sites of VP2 were mutated by reverse genetic technique in virus levels. This study will provide the potential target for anti-FMDV drug, and obtain virus strain which don't lead to apoptosis of the cultured cells, thereby increase vaccine potency.

口蹄疫（FMD）是由FMD病毒（FMDV）引起的一种严重危害猪、牛等偶蹄动物养殖业的烈性传染病。由于FMDV的高度变异性、众多血清型以及持续性感染，致使本病通过疫苗免疫手段难以有效防控。通过调控病毒诱导细胞凋亡手段，可防控病毒病的扩散和传播。本项目拟在已初步证明FMDV VP2基因可诱导宿主细胞发生凋亡，且VP2可与凋亡基因Siva结合的基础上；通过高表达和RNAi沉默技术，上调和下调Siva基因的表达水平，检测其在VP2诱导细胞凋亡过程中的作用，探究VP2诱导凋亡的信号通路及分子机制；突变VP2的不同位点，利用pull-down等技术，精确定位VP2诱导凋亡的功能位点；应用反向遗传技术，在病毒水平验证诱导凋亡的功能位点变异后VP2对细胞凋亡的影响。本项研究将为研发特异性抗FMDV药物提供靶标，并为获得无细胞凋亡作用的高效价疫苗毒株奠定基础。

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种严重危害猪、牛等偶蹄动物养殖业的烈性传染病，由于FMDV的高度变异性、众多血清型及持续性感染，致使本病通过疫苗免疫手段难以有效防控。通过调控病毒诱导细胞凋亡手段，可以防控病毒病的扩散和传播。FMDV诱导细胞凋亡的主要基因及作用的宿主蛋白尚不清楚，本课题的研究内容、重要结果、关键数据如下：.1.建立FMDV VP2稳定表达细胞系，验证了VP2可以引起细胞凋亡。.构建pIRES2-EGFP-VP2真核表达载体，通过脂质体转染BHK-21细胞，经流式细胞分选和单克隆细胞培养，获得稳定表达FMDV VP2的BHK-21细胞BHK-21-VP2；细胞凋亡诱导剂Etoposide处理BHK-21和BHK-21-VP2后，发现VP2过表达促进DNA片段化，即VP2基因诱导细胞凋亡。.2. Siva基因过表达可促进VP2诱导细胞凋亡.用细胞凋亡诱导剂Etoposide处理稳定表达VP2的BHK-21-VP2细胞，分别利用Real-time PCR和Western blot检测Siva的表达，处理后的细胞Siva表达量升高。通过流式细胞检测和caspase活性检测，Siva基因的过表达可诱导BHK21-VP2的细胞凋亡，表明Siva基因在VP2诱导细胞凋亡中发挥了作用。.3. Siva基因沉默可抑制VP2诱导的细胞凋亡.构建沉默Siva基因的慢病毒载体3个，分别与过表达载体pcDNA3.1-Siva共转染293T细胞，进行Western blot检测，筛选出沉默Siva效果最好的载体RNAi-Siva，将RNAi-Siva转染BHK21-VP2细胞系，通过流式细胞检测和caspase活性检测，沉默Siva基因可抑制BHK21-VP2的细胞凋亡，验证Siva基因在VP2诱导细胞凋亡中发挥了作用。.4. Siva蛋白与VP2的结合作用.过表达载体pcDNA3.1-Siva，转染BHK21-VP2细胞，通过免疫共沉淀，发现Siva可以与VP2结合；构建VP2的原核表达载体，进行原核表达和纯化，利用 pull-down技术，检测原核蛋白VP2未能与真核表达的Siva蛋白结合，可能是由于原核表达的VP2为线性蛋白，缺乏正确的空间结构。.本研究获得授权的国家发明专利1项，获得省部级科技奖励2项。