细胞外基质生物材料促进间充质干细胞体外增殖、分化及其调控机制的研究

Mesenchymal stem cells （MSCs） are considered as a promising source for tissue engineering and regenerative medicine because of their excellent capacities of self-renewal and multipotent differentiation. The conventional in vitro expansion system, however, limits the utilization of MSCs because in the monolayer culture MSCs rapidly loose their self-renewal ability and differentiation potentials, and result in cell senescence. Extracellular matrix （ECM） provides an essential microenvironment for MSCs and plays an important role in the cell adhesion, survival, migration, proliferation, differentiation and matrix remodeling. Therefore, reconstructing in vitro natural microenvironment for MSCs facilitates large-scale expansion of MSCs and maintains the stemness. In this proposal, we plan to generate a biomaterial based on decellularized ECM deposited by synovial cells and develop an in vitro MSC nich. Firstly, we will stimulate synovial cells to secrete ECM, and analyze its micro-structure and matrix components. Then we will use this decellularized ECM to expand MSCs in vitro, and study the influence of ECM on MSCs self-renewal capacity and cell senescence. Furthermore, we will compare the chondrogenic potential of MSCs expanded by ECM system to the traditional culture system, and analyze the mechanism of ECM regulating MSCs differentiation. Finally we will investigate the biological safety of MSCs expanded by ECM system by detecting tumorigenicity. The purpose of this proposal is to promote the utilization of MSCs in clinical applications and tissue engineering.

间充质干细胞生长所在的特定的微环境（壁龛）的外基质及各种分子对于干细胞的丰度和命运有重大影响。传统的细胞培养材料较难模拟正常间充质干细胞所需的复杂壁龛环境，因而影响到干细胞体外扩增能力、多次传代后的分化潜力。本项目针对目前细胞治疗与再生医学对于干细胞的需求，通过调控生物材料表面化学性质及细胞培养环境，诱导滑膜细胞在生物材料表面分泌特定的细胞外基质（ECM）；采用脱细胞技术及稳定化技术，在基本保存ECM生物活性物质成分的前提下，获取脱细胞的ECM生物材料；随后利用ECM生物材料对间充质干细胞进行体外培养，优化构建ECM条件，探讨ECM调控干细胞增殖和老化的机制，阐明ECM生物材料影响MSCs定向分化能力及其机理，初步验证ECM培养干细胞的应用安全性，开发一种高效的体外扩增干细胞技术。

间充质干细胞（MSCs）是组织工程重要的种子细胞来源，但是体外培养过程中容易出现增殖和分化能力减弱的问题。体内与体外生长环境的巨大变化是干细胞逐渐丧失其特性的重要原因之一。细胞外基质（ECM）是间充质干细胞体内微环境的重要组成部分，对干细胞的命运起决定性作用，因此如何利用ECM在体外重建干细胞的生长微环境并开发一种高效的干细胞体外扩增技术具有重要的研究价值。.首先，我们诱导MSCs分泌ECM，通过脱细胞处理手段获得天然的ECM生物材料，并检测ECM材料的微观结构和基质组成成分，证实ECM材料具有与体内微环境高度相仿的结构和多种基质蛋白。其次，我们将MSCs接种于ECM生物材料上，发现ECM上培养的MSCs，其增殖能力有显著提高，同时其胞内活性氧水平明显降低，仍具有干细胞的表面抗原特征。再次，我们诱导经过ECM材料培养的MSCs向软骨细胞分化，发现ECM培养方式能显著促进MSCs向软骨细胞分化，不仅提高其软骨细胞特定基因表达，而且增强软骨特定基质的表达。最后，我们验证了ECM材料培养的MSCs的生物安全性，发现ECM培养后的MSCs几乎不表达免疫细胞抗原，如HLA-DR或CD45。同时在项目执行期间，我们拓展了ECM材料调控MSCs的研究内容，发现ECM不但可以调控体内激素——褪黑素的生物功能和MSCs的生物抗氧化功能，还可以促进MSCs向肝脏细胞分化和抑制由氧化应激诱导的干细胞早衰。.目前，研究实验部分已基本完成，并且有2篇SCI论文正在撰写阶段，预计2016年投稿。此外，实际研究过程中发现ECM材料能显著影响MSCs的多向分化潜能，以及ECM材料具有良好的抗氧化功能，特别是抗早衰功能，该结果比预期的更有科学意义，我们将在整理、分析目前已有的数据结果后，近一两年内申请新的课题，进行更加系统的研究。.至今，已接受或发表SCI论文共计8篇（标注本项目批准号），国内发明专利已授权7项。