Osteopontin调控骨髓间充质干细胞（MSCs）促进创面愈合及其机制初探

成体干细胞在创面修复中的作用在近年来受到广泛关注。研究证实，骨髓间充质干细胞（MSCs）是创面修复的重要细胞来源，但其迁移归巢和促创面修复的具体机制尚不清楚。我们既往研究发现，创面组织内MSCs与创面局部Osteopontin（OPN）的高表达密切相关，两者在体内体外的定位存在关联性。结合OPN是炎症愈合的多功能关键调控因子，为此我们推测，OPN可能是调控MSCs参与皮肤损伤修复的重要分子。本课题拟以OPN-/-小鼠为研究对象，结合皮肤创面修复模型，利用基因转染、免疫荧光染色和流式细胞仪检测等多种分子生物学的技术， 对OPN具有动员、趋化骨髓MSCs迁移至创面部位，且分化为上皮细胞、血管内皮细胞等细胞表型能动地参与创面愈合作用的推论加以证实，并探讨其相关的分子机制。研究结果将有助于丰富MSCs参与皮肤创面修复的理论，为临床将来合理应用MSCs促进创面愈合提供新的理论依据。

实验以OPN-/-与野生小鼠为研究对象，建立皮肤创面修复模型，改良小鼠骨髓MSCs的提取与体外培养的方法，构建携带OPN基因的慢病毒载体并转染MSC细胞，对OPN调控MSCs的体内体外的功能动态变化进行研究；课题重点集中于MSCs的增殖、迁移、分化以及在此过程的分子机制。结果发现，骨髓MSCs在经过改良的体外培养体系在生长效率有了较大的提高，可以得到纯度>95%的MSCs细胞。相比野生的MSCs，OPN-/-细胞功能被明显抑制，野生的MSCs迁移与增殖能力显著优于OPN-/-细胞，而在分化为CK14阳性的上皮细胞、vWF阳性的内皮细胞时也优于后者。一旦用外源性或转入OPN基因载体干预，OPN-/-细胞的迁移增殖能力与CK14阳性、vWF阳性表达显著改善，而野生的MSCs细胞改善相对较弱，这些作用具有时间与剂量的正相关；OPN多方面调控MSCs在体外的功能，明显促进MSCs的增殖、迁移，有效分化为内皮与上皮细胞，尤其是体外分化过程中MSCs的细胞标记的衍变存在血管干细胞（ VSCs）的部分特征（细胞标记CD34+、CD31-)；同时，对比野生型与OPN-/-小鼠，后者的生存、生殖与寿命均较前者劣势，OPN-/-小鼠每胎仅仅2-4只新生小鼠，而野生则有6-8只，这是值得探讨的问题。在小鼠皮肤创面模型中，同样大小的创面，野生型小鼠比OPN-/-小鼠的愈合能力明显增强，平均提前愈合时间超过1天；检测MSCs细胞向创面局部募集、迁移过程及内皮、上皮等修复细胞的细胞标记表达情况，也是野生型小鼠优于OPN-/-；进一步，在创面周围区域注入1×106含OPN基因的MSCs细胞，通过无创显影，可见MSCs细胞均向创面中心区域迁移，但OPN-/-MSCs细胞快于野生细胞，荧光强度更高；另外，输入含OPN基因的MSCs细胞后，明显改善OPN-/-创面的MSCs被抑制的功能，MSCs的数量增加，区域内CK14阳性、vWF等阳性表达的细胞增多，显著优化创面修复的过程，创面愈合时间逐步接近野生小鼠；检测这些动态过程，其分子机制涉及CD44、E-selectin(CD62E)、Integrin等的信号通路，它们的激活是OPN多方面调控MSCs，发挥其作用的基础。本研究结果有许多原创，丰富了MSCs参与创面修复的理论体系。