三疣梭子蟹盐度耐受性DNA甲基化调控机理研究

The swimming crab，Portunus trituberculatus，is an important marine fishery and aquaculture species. We acquired the new variety，after selection for seven-genertaions. The new variety showed better economic traits such as salinity tolerance, and the traits of salinity tolerance can be inherited stably to offspring. But We don't know the genetic mechanism. In this study, we plan to analyze DNA methylation characterization，analyze difference of DNA methylation，based on the salt resistant and sensitive strain of Portunus trituberculatus constructed in previous research. We will establish the potentionally regulatory pathway and its network sequence by RNA-Seq whole-transcriptome. Some genes associated with effects of salinity change will be selected. Then some key gene associated with salinity regulation underlying methylation intervention will be selected . At last we will clarify epigenetic regulation mechanisms ofsalinity about Portunus trituberculatus. The results will promote stress--resistant breeding process in Portunus trituberculatus.

三疣梭子蟹是我国海水养殖的主导品种之一，本课题组经过7代家系选育，培育三疣梭子蟹耐低盐品系1个，该品系耐低盐能力显著提高，且具稳定遗传性。环境胁迫引起的生物DNA甲基化可传递给后代，从而控制基因表达以快速适应环境。为了明确三疣梭子蟹对盐度耐受的DNA甲基化调控机理，本研究筛选甲基化水平差异位点，比较耐盐品系和敏感品系基因组甲基化水平差异，挖掘耐盐性状相关差异甲基化基因及其特异甲基化位点；借助高通量比较转录组学方法，构建耐盐性状相关基因调控网络，建立耐盐性状差异表达基因与差异甲基化基因的关联模型，筛选甲基化介导的三疣梭子蟹耐盐性状关键基因，验证其甲基化水平和表达图式，初步揭示三疣梭子蟹盐度耐受性表观调控机理。研究结果为三疣梭子蟹抗逆选育提供一种新思路。

多雨季节低盐胁迫易引起池塘养殖梭子蟹死亡，是影响产业健康发展的一个技术难点；环境胁迫引起的生物DNA甲基化可传递给后代，从而控制基因表达以快速适应环境。为了明确三疣梭子蟹对盐度适应的DNA甲基化调控机理，本项目在前期研究基础上，1）建立三疣梭子蟹耐盐家系、敏感家系，提取耐盐家系、敏感家系低盐胁迫0h、72h肝胰腺、肌肉、鳃丝组织。2）采用WGBS技术完成全基因组甲基化测序，平均每个样本获得clean reads 120,992,508条，甲基化主要发生在CG双核苷酸的胞嘧啶上，mCG类型平均为70.27%；样本间平均DMR为27,925个，DMR锚定基因主要是钠钾转运ATP酶等与盐度适应调节相关功能基因；DMR锚定基因GO富集生物过程包括生物调控等过程，细胞组分包括细胞膜等，分子功能包括蛋白质结合等；DMR锚定基因KEGG富集包括ABC转运等通路。3）采用高通量测序技术完成转录组测序，平均产生clean reads 56,967,253条，平均每个样本鉴定基因14,740个，筛选盐度适应性相关差异表达基因2,078个，筛选家系间盐度适应性相关差异基因1,454个，主要和一些离子转运酶等有关；差异基因GO富集生物过程包括蛋白质分解等过程，细胞组分包括细胞膜等，分子功能包括氧化还原酶活性等；差异基因KEGG富集包括ECM受体等通路。4）开展了甲基化与转录组联合分析，转录组含DMR差异基因GO富集生物过程包括蛋白质分解代谢等过程，细胞组分包括细胞膜等，分子功能包括氢离子跨膜转运活性等；转录组含DMR差异基因KEGG富集包括ECM受体等通路；选取甲基化模式和转录组表达趋势相对应的氯通道蛋白、钠钾转运ATP酶为目标基因，进行qRT-PCR定量表达验证，低盐胁迫72h，氯通道蛋白DMR甲基化水平升高，RNA-seq和qRT-PCR定量结果降低；钠钾转运ATP酶DMR甲基化水平降低，RNA-seq和qRT-PCR定量结果升高；推测三疣梭子蟹氯通道蛋白、钠钾转运ATP酶的功能受甲基化修饰调控，机体受到盐度胁迫时，通过改变甲基化模式，调控基因表达，从而调节渗透压平衡，以适应盐度变化，初步解析三疣梭子蟹耐盐性状的表观调控机制。结果为三疣梭子蟹抗逆品种选育提供辅助。