经典Wnt信号通路中Axin构象变化的信号转导机制

The Wnt signaling pathway plays crucial roles in cell fate decisions as well as in the pathogenesis of a variety of diseases. Axin, as a key component of canonical Wnt pathway, plays dual roles in modulating Wnt signaling. On one hand, Axin scaffolds the "β-catenin destruction complex" to maintain the inhibition of Wnt signal transduction in resting state; on the other hand, Axin mediates the formation of "LRP5/6 signalosome", promoting the transduction of Wnt signaling. However, the molecular and regulatory mechanism behind Axin functional conversion remains unclear. Our previous work has identified a small molecular compound, HLY78, which could trigger the conformational switch of Axin from a "closed" auto-inhibitory state to an "open" active state, prompting Axin-LRP5/6 interaction as well as activation of the Wnt signaling. This indicates that conformational change of Axin may play a critical role in regulating its dual functions. With the use of HLY78 as a probe and Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) as the main means, this project will combine the use of techniques in multiple disciplines, including structural biology, biochemistry and cell biology to investigate the structural basis and regulatory mechanism behind Axin conformational change. This study is expected to facilitate the improvement of current LPR5/6 activation theory in the field; meanwhile, it will provide theoretical support and structural basis for the development of personalized medicine targeting Axin.

Wnt信号通路在决定细胞命运及多种疾病发生中扮演着重要角色。Axin是该通路中一个关键信号分子，在信号传递过程中发挥着双重作用：一方面介导“β-catenin降解复合物”的形成，维持Wnt信号静息下的信号通路抑制状态；另一方面介导“LRP5/6信号体”的形成，促进Wnt信号向下游传递。目前，对Axin这两种功能如何发生转换及这种转换过程如何被调控等问题仍无答案。我们前期的工作发现了一个小分子HLY78，能使Axin从一种“自抑制”构象转变为更有利于结合受体的“开放”构象，促进Wnt信号的传递，提示Axin的构象变化在其功能转换中扮演着关键角色。本项目拟以HLY78为切入点，利用荧光共振能量转移技术和结构生物学为主要手段，结合生化与细胞生物学技术及斑马鱼模式生物系统，研究Axin构象变化的结构基础与调控机制，完善现有的LRP5/6活化机制模型，并为潜在的个性化药物设计提供理论依据和结构模型。

Wnt信号通路在决定细胞命运及多种疾病的发生中扮演着重要角色。Wnt蛋白的共受体LRP5/6的磷酸化是经典Wnt信号通路信号传递的早期标志性事件。Axin/GSK3和磷脂酰肌醇二磷酸PIP2都被认为参与LRP5/6磷酸化的调控，并在其中发挥重要作用。然而，目前国际上对于LRP5/6磷酸化的调控机制尚存在一些认知上的空白，比如LRP5/6实际上存在多个磷酸化位点，这些位点磷酸化是否执行不同的功能；Axin如何响应Wnt信号参与调控LRP6磷酸化等。此外，我们前期的研究中发现一个小分子化合物HLY78，它可以改变Axin的构象并促进LRP6的磷酸化。然而在生理条件下Axin是否也存在类似的构象变化，如果是，它的调控机制是什么？对于这些问题的探索无疑将促进本领域对LRP5/6磷酸化这一Wnt膜质传递中核心事件的认识，同时，也可能为Wnt通路相关疾病的治疗提供新的思路和策略。本项目研究内容即针对这些问题，围绕LRP5/6的磷酸化调控机制，对Axin的构象变化，以及PIP2对Axin构象和功能的影响进行了一系列探索。我们首先利用CRISPR/Cas9技术构建了Axin1/Axin2 双敲除细胞系、LRP5/LRP6双敲除细胞系、和Dvl1/2/3三敲除细胞系。在这些敲除细胞系的基础上，我们对Axin构象变化和LRP5/6磷酸化之间的内在关联进行了深入的分析。我们发现PIP2和小分子HLY78虽然结合Axin的位点不同，但是它们都能够打开Axin相同片段介导的分子内相互作用，暗示PIP2很可能就是生理条件下调控Axin构象的天然小分子化合物。此外，已有研究表明Dvl蛋白通过促进PIP2上游激酶的活性在PIP2的产生过程中发挥重要作用，而本项目中，我们发现Dvl在PIP2产生后介导LRP5/6磷酸化的过程中也发挥必不可少的重要功能。另一方面，借助特异性抗体和Axin1/Axin2双敲细胞系，我们还发现Wnt通路领域内一个普遍被接受的认知，即Axin/GSK3介导LRP5/6的S1490位点的磷酸化，很可能存在较大偏差——我们的实验结果表明敲除Axin并不影响Wnt诱导的LRP5/6的S1490位点的磷酸化。综上所述，上述这些发现对于理解LRP5/6磷酸化的调控机制以及Axin/PIP2/Dvl在其中所扮演的角色提供了新的线索和研究方向，它将促使本领域重新认识LRP5/6的磷酸化过