植物雌激素调控PI3K/Akt/FoxO1信号通路在骨质疏松中的作用及机制研究

Oxidative stress is a risk factor for osteoporosis, FoxO1 as one of the important factors in the body against oxidative stress plays an important role in the anti-osteoporosis oxidative damage. In the project, the animal models of osteoporosis will be set up by ovariectomized rats. The rat models are intervented by puerarin and resveratrol, respectively. The MSCs and osteoclast of the rats are seperated and cultured. The effect and molecular mechanisms of puerarin and resveratrol regulating PI3K/AKT/FoxO1 signaling pathway and downstream target genes β-catenin、PPAR-γ、Gadd45、Bim expression on the proliferation and differentiation, antioxidant capacity, osteoblast marker genes ALP, OC, OPN, collagen type Ⅰexpression, and cell activity, bone resorption, proliferation and differentiation of osteoclast, marker genes MMP-9, TRAP and cathepsin K expression also will be observed. In addition, the cell model of oxidative stress damage by homocysteine (Hcy) in vitro to induce MSCs will be set up. Different doses of puerarin, resveratrol intervent cells, respectively, as a control to add or not to add PI3K/AKT pathway inhibitor LY294002. The protection and restoration role of puerarin, or resveratrol in Hcy inducing MSCs oxidative damage, and the effect of PI3K/AKT/FoxO1 signal pathway on antioxidant stress injury will be investigated. The implementation of this study will reveal the role and molecular mechanisms of phytoestrogens in osteoporosis oxidative stress injury, and provide the scientific basis for phytoestrogens to prevent and treat of osteoporosis in clinical.

氧化应激是骨质疏松的一个危险因子，FoxO1是机体对氧化应激反应的重要因子之一，在抗骨质疏松氧化损伤中具有重要作用。本研究通过去势大鼠骨质疏松模型，探讨植物雌激素葛根素、白藜芦醇调控PI3K/AKT/FoxO1信号通路及下游靶基因β-catenin、PPAR-γ、Gadd45、Bim表达对大鼠MSCs向成骨定向分化、抗氧化、成骨细胞标志基因ALP、OC、OPN、I型胶原表达的影响；及对破骨细胞活性、增殖分化、抗氧化、骨吸收功能、标志基因MMP-9、TRAP和组织蛋白酶K表达的影响。另外，体外建立同型半胱氨酸（Hcy）诱导MSCs氧化应激损伤的细胞模型，观察葛根素、白藜芦醇对Hcy诱导MSCs氧化损伤后的保护修复作用，及PI3K/AKT/FoxO1通路在抗氧化损伤中的作用。本项目的实施将会揭示植物雌激素在骨质疏松氧化应激损伤中的作用和分子机制，为临床上植物雌激素防治骨质疏松提供新的科学依据。

氧化应激是骨质疏松的一个独立危险因素，氧化还原调控因子FoxO1通过上调过氧化氢酶、SOD、GSH-PX等抗氧化酶的水平在骨骼内稳态中发挥基础性的调节作用。白藜芦醇、葛根素作为天然的抗氧化剂，能够通过其抗氧化活性起到骨保护作用，但其具体分子机制尚不明确。破骨细胞是体内介导骨吸收过程的唯一细胞，其活性是骨量调控的核心。在本课题中我们建立去势大鼠骨质疏松模型，以及通过核因子кB受体活化因子配体（RANKL）和过氧化氢（H2O2）对RAW264.7细胞诱导破骨细胞氧化应激模型，探究白藜芦醇、葛根素通过PI3K/AKT/FoxO1信号通路对破骨细胞分化形成、活性及骨吸收功能的影响；白藜芦醇通过Sirt1/ FoxO1信号通路对破骨细胞分化形成、活性及骨吸收功能的影响。我们的研究结果提示：1） 通过其抗氧化活性，白藜芦醇、葛根素能够降低由OVX诱导的RANKL的异常升高，上调OPG的表达，改善OPG/RANKL的比值，进而抑制破骨细胞的生成、活性和骨吸收功能，阻止骨微结构的破坏。2） RANKL通过激活AKT引起FoxO1的转录活性抑制，RAW264.7细胞的氧化应激水平升高，最终促进破骨细胞的形成，增强破骨细胞的活性；H2O2可增强RANKL诱导破骨细胞形成的效应3） 白藜芦醇、葛根素通过抑制PI3K/AKT信号通路，上调FoxO1的蛋白表达水平和转录活性，进而抑制RANKL诱导RAW264.7细胞向破骨细胞的分化，并诱导RAW264.7细胞发生凋亡，而且这种凋亡是依赖于Bim-caspase-3途径的。氧化还原调控因子FoxO1是白藜芦醇、葛根素发挥抑制骨吸收效应的关键靶点。 4） 白藜芦醇能够通过激活Sirt1上调FoxO1的转录活性和蛋白水平而抑制破骨细胞的形成、降低破骨细胞的活性、增加破骨细胞的凋亡，且这种凋亡是Bim-caspase-3途径依赖的。本课题的实施揭示了白藜芦醇、葛根素在抗骨质疏松氧化应激损伤中的作用和分子机制，为临床上应用藜芦醇、葛根素防治骨质疏松提供新的视角和科学理论依据。