PKCε/ ABCB1 信号通路调节肾癌干样侧群细胞耐药特性的实验研究

Renal cell carcinoma (RCC) constitutes the majority of urological neoplasm, which is insensitive to chemotherapy. The study of chemo-resistant mechanisms of RCC is one of the most topic in urological cancer field. Side population cells (SP cells) with cancer stem cell properties, are closely related to the development of tumors. SP cells more resistant to chemotherapy and have greater research and application value compared with regular cancer cells. Protein kinase C ε (PKCε) is a representative member of Protein kinase C family, this kinase promotes tumor cell properties, including chemotherapy resistance. Our previous study found that the expression of PKCε not only related to the malignant degree of RCC but also influenced the ability of RCC chemo-resistant. Then we identified side population cells with cancer stem-like cells including chemotherapy resistance from human RCC cell lines. The expression of PKCε and ABCB1 were detected from those cells at the same time. Our further study showed that the function of PKC ε interacted with ABCB1 could affect SP cells’ drug resistance. And ABCB1 has the capacity of drugs efflux. Based on those studies we would like to use the in vivo and in vitro model to study the effect and mechanism of PKCε/ ABCB1 signal pathway in the chemotherapy resistant of RCCs SP cells, and further test several protein regulated by this signal pathway. Finally we will test above protein related to PKCε/ ABCB1 signal pathway in human RCC tissue to explore its clinical application value.This study will explore the possible drug resistance mechanism of RCC SP cells, which can reveal the nature of RCC disease and have great significance to clinical treatment.

肾癌（RCC）是泌尿系常见肿瘤，对化疗药物极不敏感，其耐药机制尚不明确，是泌尿系肿瘤研究的热点之一。侧群（SP）细胞具有肿瘤干细胞特性,与普通肿瘤细胞相比耐药性更强。PKCε属蛋白激酶C家族，在维持包括耐药在内的肿瘤细胞生物学特性的过程中发挥重要作用。本课题组首次发现PKC ε的表达与肾癌恶性程度正相关并能影响其细胞的耐药性；紧接着我们从肾癌细胞中分离到了具有强耐药性的SP细胞，发现该群细胞表面高表达PKCε和ABCB1蛋白；进一步研究发现PKCε与药物外排蛋白ABCB1间的相互作用能影响SP细胞的耐药性。推断PKCε及ABCB1的存在很可能与RCCs SP细胞的耐药性相关。本课题在此基础上将深入探讨PKC ε/ABCB1信号通路在肾癌侧群细胞耐药过程中的作用机制，并揭示PKCε/ABCB1信号通路相关蛋白在RCCs组织中表达的临床意义。最终为RCC寻找相关耐药预测分子及耐药作用靶点提供强有力的实验依据。

在我国肾细胞癌（CSC）是泌尿系统最为常见的恶性肿瘤之一，极易复发和转移，部分病人在初诊时就已发展到晚期并具有较高的死亡率，术后肿瘤的复发率为40%。另外，肾细胞癌对传统的化学治疗、放射治疗均不敏感，免疫治疗亦收效甚微。因此很有必要进一步揭示上述现象的分子机制，从而揭示更为创新有效的治疗方法。肿瘤干细胞是未分化的一类肿瘤细胞，通常具有较强的肿瘤起源能力。肿瘤干细胞不仅与肿瘤细胞的来源和更新相关并且参与调控肿瘤细胞的治疗抵抗特性，包括肿瘤发生发展、复发转移及抗癌相关治疗（如化疗、放疗及分子靶向治疗）。另外，肿瘤干细胞具有自我更新、多向分化的潜能，进而决定肿瘤细胞的异质性特点。侧群细胞（SP）是通过流式细胞分选而得到的一群细胞，该类细胞具有强烈外排DNA染料Hoechst33342的能力。SP细胞具有肿瘤干细胞特性，包括对化疗及放疗具有较强的抵抗能力，促使肿瘤再发，并且具有很强的体外成瘤能力。本项目中我们成功从肾细胞癌769P细胞系中分离到了具有肿瘤干细胞特性的SP细胞。这群细胞具有较强的增殖、自我更新、多向分化、放化疗抵抗及体外成瘤能力。蛋白激酶Cε(PKCε)是与肿瘤起源相关的蛋白，参与肿瘤细胞的增殖，上皮样转化及化疗药物抵抗等。PKCε高表达于包括肾细胞癌在内的多种实体瘤组织中，亦与肿瘤干细胞的相关。本项目研究发现PKCε蛋白高表达于肿瘤组织中，并且于肿瘤组织的分级呈正相关，更进一步研究发现PKCε参与调控肾癌细胞的增殖、克隆形成、侵袭转移及化疗抵抗能力，起到十分重要的作用。综合考虑上述研究本项目内容认为PKCε参与调控769PSP细胞干细胞特性的调控。为论证这一假说，我们首先下调了PKCε在769P细胞株中的表达，发现PKCε的表达量与SP细胞的分选比例呈负相关，同时随着PKCε蛋白表达量的下降，SP细胞的干细胞特性亦收到抑制。另外，本研究还发现，转运蛋白ABCB1亦受PKCε调控，而ABCB1与SP细胞的分选及药物抵抗均有作用；更为重要的是下调PKCε蛋白的表达后，Akt, Stat3 及ERK的蛋白活性明显受限，而过表达PKCε蛋白后，上述蛋白活性明显增强。因此本项目充分证实了PKCε蛋白作用于肾癌SP细胞的分选，并与包括化疗耐药在内的肿瘤干细胞特性相关，而这一作用是通过PI3K/Akt, Stat3 及MAPK/ERK 信号通路实现。