PKCα调控netrin-1/UNC5B信号通路促进肾癌细胞存活机制的研究

肾癌细胞促存活通路的异常活化是导致肾癌恶性发展及凋亡抑制的重要因素，而探索肾癌促存活信号的调控机制是该领域的核心问题。本项目组的前期研究揭示了PKC α的异常活化在肾癌发生发展中的重要作用。进一步的实验显示：PKC α参与并活化了依赖性受体UNC5B及其配体 netrin-1所介导的促存活通路；UNC5B胞内段有可能的保守PKC磷酸化位点，而初步的免疫沉降实验提示了二者的结合。由此我们提出了PKC α通过直接磷酸化UNC5B调控netrin-1促存活信号的假说。本项目拟进一步采用免疫沉降、位点突变、激酶底物鉴定等方法，旨在获得PKC α直接调控netrin-1促存活通路的可靠证据，并在原代培养细胞、裸鼠模型上对遏制netrin-1/UNC5B/PKC α反馈环的治疗作用进行深入分析，进而从依赖性受体翻译后修饰这一新视角阐明肾癌细胞存活调控的分子机制，为分子靶向治疗提供重要靶点。

在恶性肿瘤中“依赖性受体”及轴突导向因子netrin-1作为对细胞凋亡/存活转化具有双重调控作用的家族被广泛研究；蛋白激酶C α (PKC α) 的异常活化更与肾癌细胞的存活密切相关。基于本课题组前期实验对PKCα在肾癌中可能底物的筛选过程中发现，PKCα可以活化netrin-1和UNC5B。本研究采用实时定量RT-PCR技术、western-blotting技术、免疫荧光技术、免疫组化技术、荧光共聚焦、流式细胞术等手段和在体、离体和细胞水平探讨PKC α 及netrin-1/UNC5B在肾癌发生发展中扮演的角色。我们首次发现：（1）PKCα及UNC5B在肾癌组织中呈现低表达，netrin-1在肾癌组织中呈现高表达；并且免疫荧光技术证实肾癌细胞系中UNC5B呈现胞浆及核膜表达，netrin-1呈现核表达；尤其免疫组化显示在高级别肾癌中，netrin-1的核表达越明显；而UNC5B在肾癌中呈现阴性表达。并且netrin-1在高度侵袭性的肾癌转移细胞系ACHN中高表达；UNC5B则在恶性程度较低的786-O细胞系中呈现较高表达；而PKC α在两株具有较高侵袭力的肾癌转移细胞系ACHN及Caki-1中具有高表达，说明PKC α可能和肾癌的转移相关。（2）PKC α的激动剂PMA（100nM）可使肾癌细胞系中UNC5B和netrin-1的表达上调，同时PKC α抑制剂Calphostin C（50nM）可逆转这种表达上调。（3）肾癌细胞系以PKC α的抑制剂处理或瞬时转染siRNA抑制PKC α表达，肾癌细胞的凋亡情况没有发生改变。（4）给予肾癌细胞稳定过表达UNC5B，结果肾癌细胞发生G2/M期阻滞，同时细胞周期蛋白表达改变（cyclinA表达升高，cyclinB1表达升高，CDC2磷酸化Tyr15位点表达升高，cyclinE表达不变），肾癌细胞增殖、迁移能力均降低。（5）利用荧光共聚焦实验我们证实PKC α和UNC5B存在胞浆及核膜的共表达，促进肾癌进展。并且利用免疫荧光技术定位ACHN过表达UNC5B后的ACHN-U细胞的UNC5B表达，发现其出现了一定数量的核表达。通过上述研究我们证实，PKC α在肾癌发展中的作用可能和激活netrin-1/UNC5B这一信号通路有关。