基于激光光镊拉曼光谱的水牛XY分离精子损伤评价体系的研究

利用XY精子之间DNA差异原理使用流式细胞仪分离XY精子的技术是实现快速扩繁良种水牛的重要技术之一。经流式细胞仪分离水牛XY精子会导致精子的损伤，而这种损伤造成精子功能和结构产生的变异及其机制尚不完全清楚。本研究拟利用激光光镊拉曼光谱仪测定分离前后（精子染色前、染色后、分离后和冷冻后）水牛精子及其代谢液的拉曼光谱，筛选出适合水牛精子及代谢液拉曼光谱的多元统计及模式识别方法，对获得的特征拉曼光谱进行归属分析，并利用拉曼成像技术对精子的损伤进行初步定位，进而确定分离精子的结构和功能变异；基于这些机理的研究，进一步优化现有水牛XY精子分离体系，筛选出2～3种新型抗冻剂或配方。本项目的研究能为改进现有水牛XY精子分离技术体系、构建一个更快速和低损伤的分离技术平台打下良好的基础，同时对哺乳动物精子及其他细胞损伤机理的深入研究具有重要的供参考价值。

本项目综合开展了水牛分离精子特性、水牛精子拉曼光谱数据分析等研究，探索了生物抗氧剂对分离精子及水牛早期胚胎的影响，取得了一些重要的研究成果，较好地完成了计划任务。目前发表文章5篇，其中SCI论文4篇。培养了博士研究生和硕士研究生各2名；研究经费按预算计划严格执行。本项目取得的研究成果如下：.1、用流式细胞仪分离水牛精子，分离、冷冻过程的不同阶段(新鲜、染色后、分选后及冷冻-解冻后)对水牛精子活力的相关参数(MOT, PMOT, VSL, VCL, VAP, BCF, LIN )有明显影响。冷冻解冻的分离精子活力相关参数(MOT, PMOT, VSL, VCL, VAP, BCF, LIN)均显著降低。.2、分离冷冻过程中，精子的线粒体活性和质膜完整性在冷冻-解冻后损伤更明显，而分离过程对其影响不大；新鲜精子经染色、分离和冷冻-解冻后，精子的凋亡率则是呈现上升趋势。另外，不同品种、不同个体的水牛分离精子经冷冻-解冻过程后，对精子的线粒体也会造成不同程度的损伤。.3、利用激光光镊拉曼光谱仪检测分离冷冻程序对水牛精子的损伤，发现精子细胞内蛋白质、碳水化合物、脂类和核酸等生物大分子结构和含量的变化，初步揭示了精子细胞膜、线粒体、细胞核的结构及组分和能量代谢的变化规律。.4、探索了水牛精子拉曼光谱数据PCA-DFA及PCA-NAA分析方法，并建立相应的数据预测模型。通过PCA联合DFA和NAA多元统计分析可区分新鲜、染色后、分选后、冷冻-解冻后精子、不同水牛个体精子。.5、探索了5种抗氧化剂保护水牛精子及促进早期胚胎发育的基本机制。①添加MLT常温下分别孵育1h、24h、48h、72h，均可明显提高精子线粒体活性；②分别添加MLT、PCB和IGF-I在水牛精子分离、冷冻过程染色液、分离收集液和冷冻稀释液中，可一定程度上减少冷冻-解冻后精子细胞器的损伤；③在水牛精子分离及冷冻程序的染色液、收集液和冷冻液中添加叶酸或谷胱甘肽后有利于保护精子DNA空间结构的构象。④在水牛精子分离、冷冻程序的稀释液中添加MLT、PCB、IGF-I、谷胱甘肽均可提高其分离精子体外受精后胚胎发育的分裂率和囊胚率，其中添加MLT、PCB和谷胱甘肽效果显著； ⑤在水牛精子分离及冷冻程序的染色液、收集液和冷冻液中添加谷胱甘肽显著提高了分离精子人工授精后的受胎率。