大鼠原代胰岛α、β、δ及pp细胞利用激光光镊拉曼光谱系统联合微流控芯片纯化及培养研究

Interaction of visible light with cellular molecule can produce Raman scattering which can be analyzed to obtain cellular molecular fingerprints. And its application in identifying and screening different cell types is the frontier research on single cell Raman spectra nowadays. Primary islet contain α, β, δ and pp cells, which are reliable cell model for diabetes research. However, the separation and purification of them remains an obstacle for researchers. Previous studies showed that there are different Raman spectral patterns among pancreatic α, β, δ and pp cells, based on which four types of islet cells could be identified and discriminated by Raman spectroscopy rapidly and non-invasively. In this study, the Raman spectra detection was performed on rat islet cells through the micro-fluidic chip which could automatically control the target cell to enter the designed bypass micro-fluidic channel when the tested cell was determined, combining with the automatic data processing and image analysis system, to finally culture and identify the collected cells. This study will provide a new non-invasive method to seperate the primary pancreatic α, β, δ and pp cells.

可见光与细胞内分子作用发生拉曼散射。通过分析拉曼散射光谱，可获得细胞的“分子指纹”。将其用于不同种类细胞的辨识、分选是目前单细胞拉曼光谱研究的前沿领域。胰岛主要包含α、β、δ及pp四种内分泌细胞，它们是研究糖尿病可靠的细胞模型。但其分离、纯化以及培养一直是困扰研究者的难题。前期研究中我们发现大鼠原代胰岛α、β、δ及pp细胞之间的拉曼“分子指纹”相异。据此，我们利用拉曼光谱系统能快速、无损、准确的识别培养中的四种原代胰岛细胞。本研究拟在前期研究的基础上将胰岛细胞通过微流控芯片进行拉曼光谱检测，结合全自动数据处理和图像分析系统，当被测细胞被系统判别为分类细胞时，微流控芯片将自动操控目标细胞进入设计好的旁路微流控通道，最终实现对原代胰岛细胞的纯化、培养和鉴定。该研究将提供一种新的无损纯化原代胰岛细胞的方法。

细胞在激光的照射下出现的拉曼散射现象，收集散射光可以无损的获得细胞的核酸、蛋白质及脂质信息。原理上可推测不同类别的细胞，以及同一细胞的不同细胞学状态所映射的光谱不同。本研究旨在证明利用此原理能无损的辨别区分四种不同类型的胰岛细胞，以及提出利用拉曼光谱无损分选胰岛细胞的微流控芯片分选方案。本研究的研究对象主要针对原代大鼠胰岛β细胞，通过本项目的实施，项目组找到了胰岛β细胞在高糖刺激下的拉曼光谱变化与β细胞胰岛素分泌活动有关的证据，并给推测其机制是由于胞吐胰岛素时细胞膜表面积及质膜刚性的涨落引起。即证实了拉曼光谱能够实时无损的辨别甚至测量同一细胞的不同细胞学状态。其次，项目组利用培养细胞贴壁及坐标定位原理，收集了大量单纯胰岛α、β、δ及pp四类内分泌细胞，形成单类细胞的训练样本。通过主成分-线性判别分析，其训练样本/验证样本交叉验证显示利用实时检测细胞拉曼光谱，大鼠原代胰岛α、β、δ及pp细 胞区分正确率可分别达到：95%、92%、77%和100%。对比传统光镜下从形态学上（依据细胞直 径大小）进行辨认（正确率仅38.3%），结果充分说明拉曼光谱能正确高效的识别四种胰岛细胞。再次，课题组建立了包括胰岛ε细胞和脑小胶质细胞在内的稀有细胞拉曼光谱研究体系。最后项目组在胰岛细胞分选体系下发明了一种微流控分选芯片及其分选系统，该微流控分选芯片包括从上向下依次堆叠的气路控制层、PDMS薄膜层、流体通道层和石英玻璃基底，该分选系统包括激光光镊拉曼光谱系统以及上述细胞微流控分选芯片。提出的“七岔路结构”微流控分选芯片能够实现检测细胞的自动引导、检测与分选，提升了原代胰岛细胞分选的效率和准确性，基于该芯片设计的分选系统采用了图像识别、拉曼光谱检测、微流控技术等，可用于纯化原代胰岛 α、β、δ 、ε以及 pp 细胞，使原代胰岛在能够在单细胞水平上进行研究，解决了本领域内的重要技术问题。