低温等离子体诱导成纤维细胞增殖促进创伤修复的机制

In recent years,low-temperature plasma (LTP) applying to biomedicine field has been become a new research hotspot.And LTP has recently been confirmed to promote wound healing on the living body. However,the mechanisms of this event are not yet clear.We speculate that LTP can promote wound healing via inducing fibroblasts(FB, which is the main cell type that is involved in the process of wound healing) proliferation. In this study, dielectric barrier discharge will be employed to generate the atmospheric LTP jet for the treatment of mouse FB cultured in vitro and mouse skin wound to explore the mechanisms of LTP promoting wound healing. First, the optimal dosage of LTP promoting wound healing would be determined by experimental detections in vitro and in vivo. Second, the emission spectra of the LTP jet would be measured to determine its components.And the scavengers of NO and reactive oxygen species would be used to determine the exact components that promoting FB proliferation in LTP. Then some technologies such as transmission electron microscope observation, flow cytometry, RT-PCR, Western blotting, electrophoretic mobility shift assay, immunofluorescence technique integrating confocal laser scanning microscopy observation,RNA interference and so on will be conducted in experiments in vitro and in vivo to explore the molecular mechanisms of LTP promoting wound healing via inducing FB proliferation. This study will provide the theoretical basis for LTP repairing wound tissue.

近年来低温等离子体（LTP）应用于生物医学领域成为一个新兴的研究热点。最新研究发现，LTP可促进创伤的修复过程，然而其促进机制并不清楚。我们推测LTP通过诱导创伤修复的主要细胞-成纤维细胞（FB）增殖从而促进创伤的修复。本项目以介质阻挡放电方法在大气压下产生氩气LTP（射流），对体外培养的FB和小鼠皮肤创伤进行处理，研究LTP促进创伤修复的机制。首先结合体外和体内实验确定促进创伤修复的LTP的最佳剂量。其次采用发射光谱分析确定LTP的成分，并结合NO和氧自由基清除剂的使用确定LTP中促进FB增殖的具体成分。然后采用透射电镜观察、流式细胞术、RT-PCR、Western blotting、电泳迁移率实验、免疫荧光技术结合激光共聚焦显微镜观察、RNA干扰等技术，从体外实验和体内实验两个层面研究LTP通过诱导FB增殖从而促进创伤修复的分子机制。本项目的完成可为LTP修复创伤的临床应用奠定基础。

背景：近年来的研究发现，低温等离子体（LTP）可促进创伤的修复过程，然而其促进机制并不清楚。本项目以介质阻挡放电方法在大气压下产生氩气LTP（射流），对体外培养的成纤维细胞（FB）和小鼠皮肤创伤进行处理，研究LTP促进创伤修复的最佳剂量和机制。内容与结果：体外实验结果显示，LTP处理15s能够促进FB增殖、分泌表皮生长因子和转化生长因子以及胶原合成。等离子体处理15s的细胞相对于不处理的对照，细胞质更丰富，细胞质中线粒体和内质网有明显的增加，表明细胞处于增殖旺盛期。流式细胞术结果发现，与不处理的对照相比，15s处理组的S期细胞百分比明显增加，而G2/M期细胞百分比明显降低（P < 0.05）。Western blotting 结果发现，NF-κB P-p65（磷酸化的p65）和CyclinD1在处理15s时表达水平最高，与不处理的对照相比，差异都有统计学意义（P < 0.05），而IκB的表达明显下降（P < 0.05）。RNA干扰阻断p65表达后，检测FB的增殖情况发现LTP并没有促进细胞增殖，并且p65蛋白表达明显下降，下游分子CyclinD1蛋白表达水平也明显下降。LTP处理后，细胞内、外液ROS和NO含量都逐渐增加。活体实验结果显示，30s处理组的小鼠伤口愈合速度最快，在第7天基本愈合，达到阳性对照组（人重组表皮生长因子）小鼠伤口愈合效果。HE染色结果表明，30s的等离子体处理剂量可以促进伤口表皮再生，肉芽组织增生和胶原沉淀。免疫荧光结果发现，与对照相比，30s的等离子体处理可明显增加伤口组织中成纤维细胞的数量，并可促进成纤维细胞分泌胶原蛋白I(COL-I)（P < 0.05）。结论：LTP通过其中的活性氧和活性氮活化NF-κB促进信号传导，引起细胞周期调控蛋白cyclinD1表达上调，进而细胞S期合成增加，导致FB增殖，从而促进创伤修复。意义：本研究为LTP修复创伤的临床应用奠定了理论基础，也为此类LTP设备进一步开发提供了科学依据。