细胞凋亡相关基因APAF1/CASP9与人类神经管畸形的相关性研究

Normal cell proliferation and apoptosis are essential for neural tube closure during early stage of embryo development. Using next generation and whole genome sequencing techniques, we performed mutation screening on 363 and 100 NTDs (neural tube defects) patients, respectively. The results indicated plenty of rare mutations are significantly enriched on programmed cell death pathway. CASP9 and APAF1 are core members of apoptosis pathway, and they interact with each other to cleave the pro-caspase-9. In this study, we identified 5 and 4 rare mutations in APAF1 and CASP9 genes (2 recurrent mutations in CASP9), respectively, which are absent in 865 control groups. Thus, we speculate APAF1/CASP9 mutations are associated with human NTDs. Although model organisms research indicated APAF1/CASP9 knock out mice have typical phenotypes of NTDs, this relationship has been not confirmed in human so far. This project focuses on 9 rare mutations in APAF1/CASP9 genes and aims to study the association between APAF1/CASP9 gene and human neural tube defects, which further expand our knowledge on mechanism of apoptosis-related NTDs.

细胞增殖和凋亡等过程的均衡是胚胎发育期神经管正常闭合的基础。我们应用二代靶向和全基因组测序技术分别对363例和100例神经管畸形(NTDs)患者进行筛查，发现细胞凋亡通路相关基因有大量突变。CASP9是凋亡的关键酶，APAF1是其激活因子，二者功能密切相关。我们在APAF1和CASP9基因中分别检测到5个和4个NTD患者特有的突变位点(CASP9中有2个突变重复出现)，而在865例正常对照中均未出现。提示APAF1和CASP9基因突变与人类NTDs发生高度相关。已有报道APAF1和CASP9基因敲除小鼠均出现露脑和颅裂畸形，但在人群中的致病性目前尚无研究。本项目拟针对筛查出的9个突变，以小鼠神经前体细胞、人胚胎干细胞和斑马鱼为模型，寻找APAF1 /CASP9基因变异导致人类神经管畸形发生的生物学证据，并阐明其致病机制，从而从细胞凋亡角度深化对NTD发生机制的理解。

神经管缺陷是常见的先天性疾病,由于胚胎发生早期的神经管闭合失败而导致。目前全球已经报道了超过250小鼠NTD致病基因的研究模型，这表明NTD病因的分子机制是复杂的。其中细胞凋亡途径APAF1、CASP9和CASP3等基因敲除小鼠出现典型的NTD表型包括严重的颅面部畸形和无脑畸形。为了进一步探索人类NTDs的病因，我们对352例NTD患者和224例正常对照进行下一代捕获目标测序，包括上述的3个凋亡相关基因。我们在三个凋亡相关基因CASP9、APAF1和CASP3检测到14个非同义基因变异（蛋白质改变，等位基因频率<1%）。这些变体都是患者特有的， 224个正常对照均不携带以上突变。其中10个突变位点在1000G数据库中没有报道。后续的序列保守型分析表CASP9R180C（p.Arg180Cys），CASP3Q217H（Gln217His）和APAF1P335R（Pro335Arg）在不同物种和CASP其他家族中极为保守。值得注意的是，这三种变体，位于蛋白质结合位点，一致被五种软件预测为有害突变，包括SIFT、Poly-phen2，Mutationtaster，Mutationtaster和Provean..接下来我们对这些候选突变进行了功能分析。之前文献报道的CASP9 C287A（活性位点）和D315A（切割位点）作为阳性对照，我们发现CASP9突变特别是R180C完全破坏了CASP9和CASP9 K292E的自我切割，同时严重影响CasP3和PARP的自我切割。（有趣的是，CASP3 Q217H我们发现AKT的磷酸化（T308）和p37亚单位的释放。蛋白质的后续分析使用酵母双杂交互作用-系统显示CASP9的共转染（WT）和APAF1激活活性2.13倍。而CASP9（R180C）与APAF1共转染未激活报告基因。.在这项研究中，我们发现NTDs患者APAF1单基因LoF变异。虽然人类NTDs的病因是多因素的，我们的研究结果表明凋亡相关基因包括CASP9，APAF1和CASP3与中国汉族人群的神经管畸形的发生密切相关。