副猪嗜血杆菌cdtABC基因簇的功能鉴定及其在细菌持续感染与致病过程中的作用研究

副猪嗜血杆菌(HPS)是严重危害全球养猪业的重要病原菌，但无毒力因子获得鉴定。体外试验发现多种细菌的CDT毒素对动物细胞具有独特的基因毒性，但其在机体内的作用仍然不详。本课题拟以本室在HPS中最新发现的cdtABC基因簇为研究对象，利用多年积累的菌株资源及其背景资料，先通过Muplex-PCR和基因标记探针等技术确定该基因簇在不同菌株的分布、基因组织结构及其核苷酸多态性，再结合细胞毒性试验确定HPS的毒素表型与基因型的相关性，并从临床上分析毒素对该菌感染与致病的影响。获得CdtABC毒素及其CdtA、CdtB和CdtC亚基，分析和鉴定各亚基的功能；构建cdtABC基因缺失突变株，通过猪的感染试验明确该毒素在HPS感染与致病中的作用及其对机体免疫功能的影响。本课题的完成不仅可以为全面阐明CDT毒素和HPS的致病作用及机理奠定基础，还可为细菌新型高效疫苗和强弱毒株鉴别诊断试剂的开发提供依据。

本课题针对副猪嗜血杆菌的潜在毒力因子细胞膨胀致死毒素进行研究，从基因水平和蛋白水平证实副猪嗜血杆菌15种血清型标准菌株都具有该毒素，说明Cdts是一个非常保守的毒力因子。副猪嗜血杆菌基因组含2个cdtABC基因簇，分别由cdtA，cdtB和cdtC3个亚基组成。研究发现单独CdtB可以诱导细胞周期抑制，CdtA和CdtC明显促进CdtB诱导细胞周期G2期抑制的能力。Cdt各亚单位可以相互作用形成一个有活性的全毒素产生最大毒性作用。分别构建Δcdt1和Δcdt2单基因缺失株以及Δcdt1Δcdt2双基因缺失突变株，细胞毒素实验表明，单独的Cdt1或Cdt2均可导致细胞膨胀和死亡，在Cdt1和Cdt2双缺失以后细菌的致细胞膨胀作用失去。Δcdt1Δcdt2基因缺失株与野生菌株相比对豚鼠的毒力显著下降，表明CDT与副猪嗜血杆菌的毒力密切相关。另一方面，体外实验研究发现CDT毒素可导致真核细胞膨胀，而单独各亚基不能致细胞病变。动物实验显示CDT腹腔注射豚鼠，可引起豚鼠肝脏和脾脏的纤维素性渗出。CDT能够导致仔猪发病和死亡，病猪呈现典型的浆液性和纤维素性渗出等。病理切片显示该毒素引起脏器组织细胞膨胀，浆膜或黏膜细胞膨胀变性，增厚甚至脱落。该研究为全面阐明CDT毒素和副猪嗜血杆菌的致病作用及机理奠定了基础，并为细菌新型高效疫苗和强弱毒株鉴别诊断试剂的开发提供了依据。