基于中药“显效形式”、“叠加作用”的理论假说研究藏药短穗兔耳草抗痛风的分子机制

Gout is a crystal-related arthropathy caused by deposition of monosodium urate crystal with high incidence, frequent recurrence and strong harmfulness. Lagotis brachystachys Maxim commonly used to treat gout, but the exact mechanism is unknown. Our previous investigation showed that the extract of Lagotis brachystachys Maxim could significanfly reduce the level of serum uric acid in hyperuricemia mice, and the result was related to its inhibitory effect on XOD and regulation of uric acid transporters, but the active ingredient and molecular mechanism of action remains to be clarified. In this study, we will isolate the effective fractions, the active components will be identified in vitro and in vivo by investigating the effect on regulation of some targets, such as XOD and 5 uric acid transporters. In addition, we will investigate the metabolites of the extract and active components by LC-MS. Thereby, we can identify the effective forms (original compounds and/or their metabolites) and additive effect on the same and different targets. This study may provide scientific basis for clinical application, development and utilization of L. brachystachys Maxim. Besides, it will provide an idea for the research of material base and mechanism of ethnic medicine.

痛风是由单钠尿酸盐沉积所致的晶体相关性关节病，发病率高且复发频繁，危害性强。短穗兔耳草在藏区常用于治疗痛风，但具体机制不明。本课题组前期研究表明短穗兔耳草提取物能够抑制黄嘌呤氧化酶（XOD）活性和调节肾脏尿酸转运体，从而显著降低模型小鼠的血清尿酸水平，但其活性成分与具体分子机制仍有待明确。本课题拟对短穗兔耳草进行化学成分分离，以XOD和5种肾脏尿酸转运体为靶标，通过分子、细胞和整体动物实验考察所得化合物对不同靶标的调控作用，确定活性成分；再利用液质联用技术，分析提取物和活性成分给药后动物的代谢产物及代谢途径，明确其“显效形式”（原形成分及/或代谢产物）及在相同靶点和不同靶点的“叠加作用”，系统阐明其分子机制。本课题的实施，将为藏药短穗兔耳草临床和开发利用提供科学依据，同时为民族药物质基础与作用机理研究提供一种参考。

痛风是由单钠尿酸盐沉积所致的晶体相关性关节病，发病率高且复发频繁，危害性强。短穗兔耳草在藏区常用于治疗痛风，但具体机制不明。本课题通过复制氧嗪酸钾盐致小鼠高尿酸血症模型，研究短穗兔耳草各部位对高尿酸血症小鼠血清尿酸水平、肝脏XOD活性及肾脏尿酸转运体URAT1、UAT、OAT1、OAT3和GLUT9的mRNA和蛋白表达水平的影响，从而得到短穗兔耳草抗痛风有效部位及作用靶点。对有效部位进行分离，得到并鉴定了36个化合物，包括7个苯乙醇苷类化合物，9个葫芦烷型化合物，9个环烯醚萜化合物，3个黄酮类化合物，8个其他类型化合物，其中有2个新化合物。开展了黄嘌呤氧化酶（XOD）抑制剂体外研究，优化了最佳实验条件，初步筛选出了具有XOD抑制活性的化合物，并计算其IC50值；选择木犀草素、木犀草苷、芹菜素3个化合物，通过细胞实验和动物实验从体内外两方面研究其抗痛风的作用及机制，结果表明木犀草素、木犀草苷、芹菜素可通过调节GLUT9、URAT1、OAT1等肾脏尿酸转运体和TLR4/TLR2-MyD88-NF-κB-NLRP3-IL-1β等炎症信号通路产生降尿酸和抗痛风作用。最后采用UPLC-Q-TOF-MS方法分析鉴定短穗兔耳草中的化学成分，共指认了72个化学成分；再采用UPLC-Q-TOF-MS方法鉴定大鼠灌胃短穗兔耳草提取物后入血的原型成分及其代谢产物，从大鼠血浆、尿液和粪便中共鉴定了37个原型化合物。以木犀草素、苜蓿素和大车前苷为指标，共从大鼠体内鉴定了43个代谢产物。通过以上研究初步明确了短穗兔耳草抗痛风活性成分（原型成分及/或代谢产物，即“显效形式”）及其在相同靶点和不同靶点的“叠加作用”，系统地阐明其分子机制。本课题的实施，为藏药短穗兔耳草临床和开发利用提供科学依据，同时为民族药物质基础与作用机理研究提供一种参考。