乳腺癌循环肿瘤细胞中多巴胺受体（DR）表达水平的临床意义及其作用机制研究

Monitoring tumor dynamics and accurate assessment of tumor metastatic potential are critical in reducing breast cancer mortality. Circulating tumor cells (CTC) is a noninvasive tumor biomarker and working well in tumor diagnosis and detection. However, CTCs with different phenotypic characteristics indicate different metastatic potential, and identifying the most aggressive metastatic tumor cells is a key in CTCs clinical research and application. Circulating tumor stem cells are thought to be the few highly viability and metastatic CTCs. Dopamine receptor (DR) is a potential marker of tumor stem cells, and not expressed in normal hematopoietic stem cells and other adult stem cells, which made DR an ideal circulating tumor stem cell marker. We will combine CTC negative enrichment with immunofluorescence staining and fluorescence in situ hybridization to detect the DR expression on CTCs in breast cancer patients; whereas gene expression of DR subtypes in CTC will be detected by digital PCR as well. The DR expression of breast cancer CTC on both protein and gene level will be compared to the patient's pathology information and follow-up data, and the relevance of DR expression in breast cancer CTC and tumor metastasis will be analyzed. DR-positive and DR-negative CTC will be collected using Laser Micro-Desection system, and their transcription data will be detected by RNA-Seq technology to find out the relevant factors and mechanism of DR-related pathways. Targeted drugs for DR molecules have entered clinical validation phase. This project will provide a simple non-invasive method for the application of medication guide for targeted drug in breast cancer.

实时监控肿瘤负荷，准确评估肿瘤转移潜能，是降低乳腺癌死亡率的关键。循环肿瘤细胞CTC是一种无创高效的肿瘤负荷监控指标，然而不同表型的CTC转移潜能不尽相同，寻找最具转移性和侵袭性的CTC是其临床研究和应用的关键。循环肿瘤干细胞被认为是少数具有高度生存力和转移性的CTC。多巴胺受体DR是一个潜在的肿瘤干细胞标志物，且不表达于造血干细胞和其他成体干细胞，是一个理想的循环肿瘤干细胞标志物。本项目将CTC阴性富集结合免疫荧光染色和原位荧光杂交，检测乳腺癌CTC的DR表达；用数字PCR技术检测DR各亚型的基因表达，对比患者的病理信息和随访数据，分析乳腺癌CTC中DR表达水平对肿瘤转移的预后指导意义。并对DR阳性和DR阴性的CTC分别进行显微切割和单细胞RNA-Seq，分析DR通路因子及作用机理。针对DR的靶向药物已进入临床验证阶段。本项目的开展将为该靶向药物在乳腺癌中的应用提供用药指导依据。

循环肿瘤细胞（CTC）是包括乳腺癌在内的多种肿瘤的一种无创高效的肿瘤负荷监控指标。CTC具有肿瘤的异质性，有多种亚型，而寻找最具转移性和侵袭性的CTC是其临床研究和应用的关键。基于目前的研究，尚无公认的肿瘤干细胞或者乳腺癌干细胞的特异标志物。本研究通过多种潜在的肿瘤干细胞标志物的挑选和比较，发现多巴胺受体（DR）是一个潜在的乳腺癌肿瘤干细胞标志物，在造血干细胞中不表达，是一个理想的循环肿瘤干细胞标志物；同时CD147+的乳腺癌肿瘤细胞也有具有自我增值、体外分化、以及成瘤的干细胞特性。本研究通过比较不同循环肿瘤细胞检测方法，选择了基于抗白细胞标志物（anti-CD45）结合磁珠的阴性富集技术进行乳腺癌CTC富集，然后联合免疫荧光染色和FISH技术（iFISH-CTC）对乳腺癌患者进行CTC检测，并证实了其在乳腺癌临床应用中的价值；然后分析了DR五个亚型（DRD1、DRD2、DRD3、DRD4以及DRD5）在乳腺癌中的表达情况，并将研究重点锁定在了乳腺癌和癌旁组织中差异表达最高的亚型DRD4上；以具有DRD4和/或CD147表达的乳腺癌循环肿瘤细胞为研究对象，将DR和/或CD147表达检测整合到iFISH-CTC技术中，结合外周血CTC中DR/CD147的表达和入组患者临床指征，综合分析DR/CD147的表达与乳腺癌患者肿瘤转移与预后的相关性，证实了DR/CD147阳性CTC与乳腺癌患者的淋巴结转移相关，为建立基于无创的外周血生物标志物进行个体化诊疗的方法提供依据；另外通过比较CD147表达阳性和阴性的CTC的转录组数据，找出影响两者表达的差异影响因子SLC34A2和SOX2，结合体外功能实验，揭示了SLC34A2通过调控SOX2基因以维持PI3K/AKT通路的活性，并影响了CD147在乳腺癌细胞中表达的作用机制。