抑制GSK3β对缺血损伤后视网膜神经节细胞的保护作用及其分子机制

Retinal ischemia can cause DNA damage of neurocytes even to death, which seriously injure the vision of patients. Our previous study confirmed that lithium can up-regulates the transcription factor P-CREB1 expression, P-CREB1 promotes the expression of DNA ligase IV, thereby enhancing the DNA non-homologous end-junctions (NHEJ) repair of retinal neurocytes. Our preliminary experiment showed that: inhibition of GSK3β can improve the retinal ganglion cells (RGCs) viability and up-regulate the expression of Ligase IV after nutrient deprivation. However, It is not clear that whether GSK3β inhibition could enhance DNA NHEJ repair by Ligase IV in retinal ganglion cells, and whether the transcription factors P-CREB1 is regulated by GSK3β. Therefore, in this study, we will use siRNA interference, overexpression and inhibitors to regulate the expression of GSK3β and to detect the DNA NHEJ repair by flow cytometry, use Western Blot and promoter analysis to reveal the molecular mechanism of GSK3β regulating Ligase IV in primary cultured rat RGCs. In vivo, the protection mechanism of GSK3β inhibition will be confirmed by the ischemia–reperfusion injury on rat retina. This study will provide a theoretical basis for the treatment of retinal ischemic disease.

视网膜缺血可导致神经细胞DNA断裂甚至死亡，严重影响视力。我们前期研究证实：锂能上调转录因子P-CREB1，P-CREB1促进DNA连接酶Ligase IV的表达，从而提高视网膜神经细胞非同源末端连接(NHEJ)的修复效率，促进细胞存活。预实验也表明：抑制GSK3β能提高缺血损伤后视网膜神经节细胞（RGCs）活性及上调Ligase IV的表达。但是，抑制GSK3β活性是否提高RGCs中NHEJ修复效率、上调Ligase IV表达是否与转录因子P-CREB1相关？目前仍不清楚。因此，本项目将在体外利用siRNA干扰、过表达以及抑制剂调节GSK3β的表达或活性，流式细胞仪检测细胞内NHEJ修复效率；免疫印迹、启动子分析等实验揭示GSK3β调节Ligase IV的分子机制；体内以大鼠急性高眼压模型验证抑制GSK3β对RGCs DNA稳定性及分子机制。该研究将对治疗视网膜缺血性疾病提供理论依据。

视网膜神经细胞为终末分化细胞，视网膜缺血、炎症等可导致视网膜神经细胞的DNA断裂及死亡，严重损害视力。本研究以大鼠原代视网膜神经细胞培养及急性高眼压模型为载体，通过siRNA干扰、过表达以及抑制剂调节GSK3β的表达或活性，采用基因表达检测、免疫印迹、启动子分析等实验方法，揭示了氯化锂及其抑制剂降低Gsk-3β活性是通过增加Gsk-3β磷酸化实现，使P-Creb1上调Ligase IV的表达，从而促进视网膜神经细胞的DNA修复，达到保护视网膜神经细胞及视功能的目的。本研究不仅为Gsk-3β抑制剂的视网膜保护机制提供了新的见解，也为研究缺血视网膜神经保护药物提供了理论依据。在此基础上，我们对氯化锂的视网膜神经保护进行了深入研究：以原代视网膜小胶质细胞培养及视网膜炎症反应EIU模型为载体，通过基因表达、细胞活性检测、原位凋亡检测、ELISA，OCT和ERG等实验方法，探讨了氯化锂可能是通过PI3K/AKT/NFκB细胞信号通路抑制视网膜小胶质细胞的活化，减少相关炎症因子如TNF-α、IL-6和iNOS的释放，从而达到保护视网膜神经细胞和视功能的效果。本研究为拓宽氯化锂在临床中的应用提供了坚实的理论基础，并为临床中炎症性视网膜损伤的治疗提供了新的策略和治疗途径。