遗传性痉挛性截瘫新致病基因FARS2的鉴定及致病机制研究

Hereditary spastic paraplegia (HSP) is a clinically and genetically heterogeneous group of neurodegenerative disorders. We have identified the new candidate gene FARS2 of HSP in a Chinese consanguineous family with pure form of autosomal recessive HSP, which encoding mitochondrial phenylalanyl transfer RNA (tRNA) synthetase (mtPheRS). The aminoacylation activity of mtPheRS was severely disrupted by the D142Y substitution in vitro. Based on this result, we intend to do further research on pathogenicity of FARS2 gene in cellular and animal model level. We will detect morphology, vitality, proliferation, the activity of mitochondrial RC complexes, amino acid metabolism and so on in fibroblast, meanwhile the FARS2 missense mutation animal model in rat will be constructed by the CRISPR/Cas9 gene editing techniques, and the expression pattern and location of the FARS2 protein, development of the central nervous system, activity of mitochondrial RC complexes, activity of enzyme mtPheRS, amino acid metabolism and moto function of the rat model with different genotype will be detected. Thus we can evaluate the pathogenicity of FARS2 and discusse its pathogenic mechanism comprehensively. The further study of this project will probably provide reliable scientific basis of the relationship between FARS2 gene and human diseases and its pathogenic mechanism.

遗传性痉挛性截瘫HSP是一组较罕见的具有高度临床和遗传异质性的神经退行性疾病。在前期研究中，我们已在一HSP的近亲家系中鉴定出一新的致病基因FARS2，编码苯丙氨酰tRNA-合成酶mtPheRS，体外的mtPheRS蛋白的氨酰化活力测定中发现，c.424G>T (p.D142Y)变异位点可严重破坏mtPheRS的酶活力。本项目拟通过患者皮肤成纤维细胞的培养来检测FARS2变异位点对于细胞的生长发育、线粒体功能等方面的影响，同时拟采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建FARS2基因定点突变的大鼠动物模型，检测突变大鼠体内FARS2的表达与定位、中枢神经系统的发育、线粒体呼吸链、 mtPheRS酶的活力、氨基酸代谢及大鼠的运动功能等，从而在个体水平、细胞水平和动物模型水平来综合评价FARS2的致病性。本项目的深入研究将为揭示FARS2与人类疾病的的关系及HSP的致病机制提供可靠的科学依据。

遗传性痉挛性截瘫是一类遗传和临床高度异质性的神经退行性疾病。临床特征以双下肢的痉挛性截瘫为主，迄今已有超过60个相关基因被鉴定和分离。致病机制涉及线粒体代谢，脂质代谢，髓鞘形成，高尔基体及内质网的形成等等。本研究在一遗传性痉挛性截瘫的近亲家系中分离和鉴定了一新的致病基因FARS2，编码苯丙氨酰tRNA合成酶。家系验证结果显示c.424G>T(p.D142Y)的变异位点在家系中共分离，符合常染色体隐性遗传规律。之后我们课题组采用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了FARS2基因定点突变的大鼠模型，通过免疫组化实验，明确了FARS2基因高表达在高耗能的中枢神经系统中，且与线粒体的特异性抗体共表达。通过在野生型，杂合型和纯合型大鼠中的比对研究，发现FARS2蛋白在纯合型大鼠模型中的表达量较野生型有所降低。WerternBlot结果与其保持一直。线粒体相关功能实验测定显示，在在三组大鼠中，ATP及乳酸含量的测定结果显示在纯合型大鼠中，ATP含量显著低于野生组，乳酸含量显著高于野生组，且纯合型大鼠的线粒体呼吸链复合物I、II、III、IV的酶学活性均显著低于野生组，提示FARS2基因的点突变影响了线粒体的能量代谢。进一步的大鼠行为学测定发现纯合型大鼠表现出爬行姿势异常，包括颈部偏向一侧、不停转圈爬行、后肢疑似瘫痪等现象。在强迫游泳实验中，纯合型大鼠表现出比野生型较差的四肢及尾部协调性以及运动效能。同时在瞬转的细胞系中，线粒体的功能也受损，结果与模式动物保持一致。本研究在个体水平、细胞水平及动物水平共同揭示了FARS2基因的点突变的致病性，推测其可能通过影响了线粒体的能量代谢，进一步影响了中枢神经系统的功能，进而引发了痉挛性截瘫的临床表型。为深入揭示FARS2基因的致病机制及下一步的基因治疗奠定了基础。