BALB/c和C57BL/6N小鼠MHCⅠ分子结合微小隐孢子虫CTL表位特性研究

Cryptosporidium is one of the most common protozoan parasite worldwide. Analysis of mouse major histocompatibility complex (also named histocompatibility system 2, H-2) combined with cytotoxic T lymphocyte(CTL) epitopes of Cryptosporidium are essential for the design of CTL epitope vaccine to control the Crytosporidiosis and further to understand the mechanism of the cellular immune response against Cryptosporidium. In this study, the T cell epitopes from Cryptosporidium parvum binding with H-2Kb and H-2Kd molecules of BALB/c and C57BL/6N mouse will be screened using bioinformatics methods. The selected peptides will be synthesized, and their binding affinities with H-2Kb and H-2Kd molecules will be checked by co-refolding and FPLC (fast protein liquid chromatography). At last, the functional CTL epitope peptides will be identified by MHC tetramer, flow cytometry (FCM) and enzyme linked immunospot assay (ELISPOT). The MHCⅠ-peptide-β2m complex（p MHCⅠ）will have been determined using the hanging-drop vapor diffusion technique. The mechanism of presention epitopes will have been elucidated from the point of structural biology, and this results will benefit the development of CTL vaccines aganist Cryptosporidiosis.

隐孢子虫是一种全球普遍存在的人畜共患性原虫。研究小鼠主要组织相容性复合体（H-2）结合隐孢子虫表位的机理，鉴定隐孢子虫细胞毒性T淋巴细胞（CTL）交叉表位对于控制隐孢子虫病和理解隐孢子虫细胞免疫机制有重要的价值。本项目拟利用生物信息学和免疫学技术手段，筛选BALB/c和C57BL/6N小鼠MHCⅠ（H-2Kb, H-2Kd）分子所能结合的微小隐孢子虫表位；人工合成表位多肽，利用体外共复性、快速蛋白液相色谱等技术鉴定多肽与相应小鼠MHCⅠ分子的亲和力；进一步利用四聚体、流式细胞术及酶联免疫斑点等技术，鉴定体外亲和力强的多肽是否为功能性CTL表位；并通过悬滴法结晶小鼠MHCⅠ-多肽-β2m （MHC Ⅰ-peptide-β2m，pMHCⅠ）复合体；从结构生物学角度分析小鼠 p MHCⅠ呈递微小隐微小孢子虫CTL表位的特性，同时为微小隐孢子虫CTL表位疫苗的研制提供理论支持和数据储备。

隐孢子虫是一种全球普遍存在的人畜共患性原虫。研究小鼠主要组织相容性复合体（H-2）结合隐孢子虫表位的机理，鉴定隐孢子虫细胞毒性T淋巴细胞（CTL）交叉表位对于控制隐孢子虫病和理解隐孢子虫细胞免疫机制有重要的价值。本研究中，我们应用生物信息学方法、体外共复性法和快速蛋白液相色谱等技术预测并鉴定了203个H-2Kb和HLA-A*0201限制性隐孢子虫表位。其中7个T细胞表位(Gp40/15-SVFA9、Gp900-VIM9、CSL-MIW9、Gp900-KML9、Gp900-MIY9、Gp40/15-VTF10、Gp900 -SVS9) 能在体外与H-Kb分子形成稳定的复合物，且其中三个表位(Gp40/15-SVFA9、Gp900-VIM9、Gp900-MIY9)能与人群中广泛表达的HLA-A*0201分子稳定结合，这提示H-Kb可能与HLA-A*0201具有交叉CTL表位。为进一步鉴定这些表位的生物学功能，我们利用四聚体技术、流式细胞技术、酶联免疫斑点技术(ELISPOT)和细胞内细胞因子染色方法鉴定了体外亲和力强的多肽是否为功能性CTL表位，结果表明：Gp40/15-SVF表位能刺激C57BL/6小鼠脾细胞产生更多IFN-γ和T细胞免疫应答；最后通过悬滴法结晶了小鼠MHCI-多肽-β2m (MHCI-peptide-β2m，p MHCI)复合体，筛选了H-Kb/mβ2m/ Gp40/15-SVF9、H-Kb/mβ2m/ Gp900-VIM9、H-Kb/mβ2m/ Gp40/15-VTF10、H-Kb/mβ2m/CSL-MIW9四条多肽的晶体生长条件，解析了H-Kb/mβ2m/ Gp40/15-SVF9的晶体结构，从结构生物学角度阐述小鼠p MHCI呈递微小隐微小孢子虫CTL表位的特性。该研究为促进人们对抗隐孢子虫免疫应答的理解和抗隐孢子虫病疫苗的研究提供了理论依据。