咖啡因对糖尿病膀胱神经递质CGRP及收缩功能的影响机制研究

The incidence of diabetes is ever-increasing and the complications of diabetic cystopathy seriously affects the quality of life , but it is still lack of the treatment. Bladder detrusor dysfunction is defined as myogenic factors and polyneuropathy in response to hyperglycemia. Nonadrenergic noncholinergic never and receptors play an important role in diabetic cystopathy , accounting for 40%-50%. Calcitonin gene related peptide is a major bladder sensory nerve transmitters, the content of CGRP（Calcitonin gene related peptide) and innervation significantly reduced especially in the submucosal plexus of diabetic rat bladder. Caffeine is the agonist of RyR, it can induce the release of RyR-sensitive calcium, and enhance the calcium sensitivity of muscle fibers and smooth muscle contractile function. Our previous study have shown that caffeine can improve early diabetic bladder dysfunction. Pre-experiment found that CGRP protein and mRNA expression markedly increased in bladders and dorsal root ganglion of caffeine group compared to DM group. On this basis, our study is aimed to investigate the mechanism of caffeine on the improvement with diabetic cystopathy, detect of the changes of CGRP receptor and its downstream factors in animal and cell level, explore new ways for treatment of diabetic cystopathy.

糖尿病发病率日益增高，其并发症糖尿病膀胱严重影响患者生活质量，迄今仍是其研究领域的难点。高血糖导致的肌源性及神经源性病变协同作用引起逼尿肌收缩功能受损，非胆碱能非肾上腺素能神经与受体在糖尿病膀胱病中发挥重要作用。降钙素相关基因肽（CGRP)是膀胱感觉神经的主要递质，糖尿病大鼠膀胱黏膜下神经丛CGRP含量及神经分布明显减少。咖啡因作为细胞肌浆网兰尼碱受体（RyR)的激动剂，能引发对RyR敏感的钙库释放，增强肌纤维对钙离子的敏感性及平滑肌收缩功能。我们前期研究首次报道咖啡因可改善糖尿病早期膀胱功能障碍，预实验发现咖啡因组大鼠膀胱壁及背根神经节的CGRP蛋白及mRNA表达含量较糖尿病组明显升高。本项目拟在前期工作基础上探索咖啡因改善糖尿病膀胱病的机制，通过动物水平和细胞水平验证咖啡因调节CGRP受体变化及其下游信号分子的表达差异，探索糖尿病膀胱治疗新途径。

研究背景：糖尿病（Diabetes mellitus，DM）发病率日益增高，其并发症糖尿病膀胱严重影响患者生活质量，迄今仍是其研究领域的难点。研究内容：本项目拟在成功构建DCP大鼠模型、高糖环境下背根神经节神经元（Dorsal root ganglion neruons，DRGN）、膀胱平滑肌细胞（bladder smooth muscle，BSMC）培养的基础上，应用ELISA、TUNEL、RT-PCR、Western blot、流式细胞分析、免疫荧光、免疫组织化学、MTT等分子生物学技术，探索咖啡因治疗DCP病的疗效可能机制，同时为咖啡因治疗DCP提供理论依据，探索治疗DCP的新策略。研究结果：1. STZ能够成功诱导大鼠DM模型，DM大鼠膀胱排尿功能下降，咖啡因能够改善大鼠DCP功能；DM大鼠DRG以及膀胱组织中NGF、BDNF、CGRP水平下降，咖啡因能够一定程度促进其水平的恢复； 2. DM大鼠DRG中出现凋亡细胞，咖啡因能一定程度保护GRG中细胞免于凋亡；DM大鼠膀胱组织中凋亡基因Bax水平增高，抗凋亡基因BCL-2水平下降，凋亡细胞增多，咖啡因能够一定程度逆转这种情况； 3. DM大鼠膀胱组织中CGRPR、α-SM-actin水平下降，咖啡因能够促进DM大鼠膀胱组织中CGRPR、α-SM-actin的表达； 4.咖啡因可能通过神经和平滑肌两个方面的保护作用，从而改善DM大鼠的膀胱功能，其中可能至少涉及CGRP/CGRPR有关的信号通路；5. 体外高糖环境下未诱导大鼠DRGN的凋亡，但抑制了DRGN的NGF、BDNF、CGRP的表达，咖啡因能够一定程度促进其水平的恢复，可能与咖啡因作为肌浆网RyR 受体激动剂调节细胞内钙离子浓度有关； 6. 体外高糖环境下未诱导大鼠BSMC的凋亡，未影响BSMC的增殖，但抑制了BSMC收缩蛋白α-SM-actin的表达，CGRP能够一定程度促进其水平的恢复； 7. 体外高糖环境下抑制了大鼠BSMC的P38、ERK信号通路，CGRP能够一定程度促进其水平的恢复； 8. 体外高糖环境下咖啡因对DRGN具有保护作用，促进了CGRP的表达，后者能够调节BSMC胞内P38、ERK信号通路，促进体外高糖环境下BSMC收缩蛋白α-SM-actin的表达重塑。该研究为应用咖啡因治疗DCP提供了试验和理论依据。