基于糖识别检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的电化学生物传感阵列研究

Escherichia coli O157:H7 infection has become a global public health and food safety problem. Therefore, developing a rapid and sensitive method for E.coli detection is of great importance for early diagnosis and effective control of the disease. In this project, a high throughput and integrated electrode array is designed and a new analytical method for E.coli O157:H7 detection was proposed based on carbohydrate recognition mechanism using label-free electrochemical impedance spectroscopy. Firstly, four kinds of pyrene conjugated carbohydrates are respectively assembled on the surface of single-wall carbon nanotubes by π-π stacking. Meanwhile, an electrode array with 16 reaction units and integrated three-electrode working system are designed. Then four kinds of carbohydrate-based biological sensitive membranes are respectively constructed. Electrochemical impedance spectroscopy is used to study the interaction mechanism between carbohydrates and escherichia coli O157:H7 in order to screen the carbohydrate molecule which can specifically recognize E.coli O157:H7. Moreover, the specific biosensor interface based on the carbohydrate functionalized single carbon nanotubes composite is created. This biosensor is expected to exhibit a lower detection limit of 10 CFU/mL within one hour and will be used for E.coli O157:H7 detection in drinking water.

肠出血性大肠杆菌O157:H7（E.coli O157:H7）感染已成为全球性的公共卫生和食品安全问题，对其进行快速灵敏的检测对于该病的早期诊断及疫情有效控制至关重要。本项目设计了高通量、集成的微阵列电极，提出了基于糖识别原理检测E.coli O157:H7的无标记电化学阻抗新方法。具体而言，首先将四种芘基共轭糖通过π-π相互作用分别组装在单壁碳纳米管表面，同时设计含有16个反应单元并集成有三电极工作体系的微阵列电极，在其上构建四种糖基复合物的生物敏感膜，研究糖与E.coli O157:H7的相互作用机制，进而筛选出能够特异性识别E.coli O157:H7的糖分子，构建基于特定糖功能化单壁碳纳米管复合物的生物传感界面，实现一个小时内对浓度低于10 CFU/mL E.coli O157:H7的检测，并将该方法应用于饮用水中E.coli O157:H7的快速灵敏检测。

致病菌感染已成为全球性的公共卫生和食品安全问题，因而对致病菌进行高效地富集和快速灵敏的检测对于保证食品安全和控制食源性疾病的暴发和流行具有重要的研究意义。为此，本项目设计了双螺旋-鱼骨形微流控芯片，应用于大肠杆菌O157 (E.coli O157)、副溶血性弧菌 (VP) 和单增李斯特菌 (L. monocytogenes) 的高效富集，同时联合质谱检测技术，实现了对所富集的多种致病菌的高灵敏检测。双螺旋通道和鱼骨形结构的协同作用增大了致病菌气溶胶在芯片通道内流动时的阻力，提高了致病菌与微通道的接触几率，对致病菌气溶胶的富集效率高达99.99 %，远高于传统的落板法。同时，我们以双螺旋-鱼骨形微流控芯片为主要模块，搭建了便携式的微生物气溶胶采样器，成本较低约150元，采样时间缩短至半小时之内，不依赖于外接电源，便于携带，有望应用于现场的微生物采样。此外，为发展快速、灵敏的致病菌检测方法，我们首先设计了矿物油饱和的聚二甲基硅氧烷（PDMS）液滴微流控芯片，基于此发展了液滴数字PCR (ddPCR) 方法用于大肠杆菌O157和单增李斯特菌的双重检测，该方法对于纯细菌培养物的DNA具有单拷贝的检测能力，可实现对实际水样中低至10 CFU/mL致病菌的高灵敏检测。在芯片中掺入矿物油有效降低了亲油的PDMS对液滴油相的吸收，有效增强了液滴在PCR扩增中的热稳定性。进一步地，为了提高液滴的通量和避免因掺入矿物油所致的芯片键合问题，我们设计了尺寸更小的双通道T型微结构，并将用于液滴存储的玻璃腔体（glass）与产生液滴的PDMS模块紧密连接形成PDMS-glass芯片。该ddPCR芯片产生的液滴尺寸小（d=20 μm）、通量高（百万个）。储存于玻璃腔体中的液滴在整个实验过程中无需转移，可直接在原位PCR仪上进行扩增，热循环后液滴仍能保持良好的稳定性。基于PDMS-glass芯片的ddPCR方法实现了副溶血性弧菌和沙门氏菌的同时高灵敏检测，检测限可低至10 CFU/mL，定量的线性范围可跨越5个数量级（10-100,000 copies /μL），且定量结果与DNA 理论参考浓度间有很好的相关性。