以LncRNA-PVT1为主靶点的回回甘松饮干预KK-Ay小鼠早中期肾纤维化EMT分子机制研究

Diabetes-induced renal fibrosis (RF) serious harm to human health,the exact mechanism has not been fully elucidated.In the early and mid-RF process,PVT1 is the important regulatory factor that TGF-β1-induced renal cell type Ⅱ mesenchymal transition (EMT),and an important node in G6PD/ROS/p38MAPK pathway.We hypothesized that:PVT1 can effectively regulate G6PD/ROS/p38MAPK pathway,which will become a new mechanism of RF.Previous studies found that:Based on the Hui medicine "Four Xing" theory,Hui-hui Gan-song Yin(HGY) is effective in improving clinical symptoms of patients with diabetic nephropathy;and lower blood sugar and blood lipid in DM rats.To clarify HGY’s efficacy and mechanism in the early-mid RF,this study intends to introduce KKAy mouse model.The use of molecular biology,confocal laser technology and tools,from animals-cells-molecular level to putting PVT1 as the main target,observing HGY regulate G6PD/ROS/p38MAPK pathway in mice as early-mid RF and podocyte cell EMT mechanism.

糖尿病(DM)所致肾纤维化(RF)严重危害人类健康。LncRNA-PVT1是早中期RF过程中，TGF-β1诱导Ⅱ型间质转化(EMT)的重要调节因子,并且是G6PD/ROS/p38MAPK通路的重要节点。我们推测：LncRNA-PVT1能调控G6PD/ROS/p38MAPK通路，将成为RF发病的一个新机制。前期研究发现：基于回医“四性学说”组方的回回甘松饮(HGY)有效改善糖尿病肾病患者临床症状,并可降低DM大鼠的血糖与血脂。为阐明HGY对早中期RF的药效及机制，本课题拟引入KK-Ay小鼠，观察HGY药效;运用分子生物学、激光共聚焦等技术和手段，从动物-细胞-分子水平，以LncRNA-PVT1为主靶点，观察HGY调控G6PD/ROS/p38MAPK信号通路干预KK-Ay小鼠早中期RF中足细胞EMT的机制。本课题从回医理论出发，以LncRNA-PVT1为切入点,阐明HGY对早中期RF的分子机。

背景:糖尿病肾病是糖尿病最严重的微血管并发症之一,将近20%-40%的DM患者最终发展为DKD,且超过40%的终末期肾病患者也是由DKD发展而来.而现代医学治疗主要以血糖及血压,目前没有很好的治疗手段,所以人们将目光转向了民族医学这个医学宝库.研究内容：观察回回甘松饮（HGY）对KK-Ay自发性糖尿病小鼠早中期肾间质纤维化（RIF）的干预作用，探究HGY对高糖诱导的肾小球足细胞（MPC5）增值、周期以及相关通路蛋白的影响.通过动物实验和细胞实验共同揭示HGY以lncRNA-PVT1为主靶点调控G6PD/ROS/p38MAPK/TGF-β1信号转导通路,抑制上皮间质转分化（EMT）的发生,延缓糖尿病肾病早中期肾纤维化的分子机制.结果：与模型组比较,HGY干预后,动物毛色、精神状态有所改善,体重、空腹血糖显著下降（P<0.05）;TC、TG、LDL、BUN、Scr也明显降低（P<0.05）,而HDL升高（P<0.05）.组织病理学显示:动物早中期肾小球、肾小管及肾间质、细胞足突均有明显的修复及保护作用.免疫组化显示:HGY给药组较模型组α-SMA、p38MAPK、Laminin-1蛋白表达显著降低,而E-cadherin蛋白表达显著增加（P<0.05）.RT-PCR法检测结果显示:动物LncRNA-PVT1、p38MAPK mRNA水平显著降低（P<0.05）.Western Blot显示:动物ROS、TGF-β1、p38MAPK蛋白表达显著下降,G6PD蛋白显著升高（P<0.05）.在高糖诱导下,足细胞数量显著增多,细胞活力增加.高糖诱导足细胞,其增殖显著抑制（P<0.05).流式细胞结果显示:不同HGY使得G0/G1期细胞所占比例减少,而S期细胞比例增加（P<0.05）.ELISA结果显示:不同浓度HGY可下调足细胞中p38MAPK、ROS、TGF-β1、FN、ColⅠα2蛋白表达,上调G6PD蛋白表达（P<0.05）.Western Blot显示:可下调高糖诱导足细胞中ROS,p38MAPK,TGF-β1蛋白表达,上调G6PD蛋白表达（P<0.05）.RT-PCR显示:可下调高糖诱导的足细胞中LncRNA-PVT1 mRNA、p38MAPK mRNA表达（P<0.05）.结论:以LncRNA-PVT1为主靶点,可有效调控G6PD/ROS/p38MAPK信号通路.